PEDVN基因重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及其對(duì)Vero細(xì)胞的影響.pdf

1、目前在全世界范圍內(nèi)流行并給許多養(yǎng)豬戶造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的疾病當(dāng)中，豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)占有絕對(duì)地位，它是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種豬的急性、熱性、高度接觸性腸道傳染病，PEDV屬冠狀病毒科中的α冠狀病毒，感染該病的豬常表現(xiàn)出體溫一般正常、強(qiáng)烈嘔吐、水樣腹瀉等特點(diǎn)，仔豬和育肥豬感染后發(fā)病率接近100％，仔豬死亡

2、率通常在一半以上，成年母豬發(fā)病率在20％左右，一般可耐過(guò);PED的傳播速度較慢，在控制不及時(shí)的情況下一般在一個(gè)月之內(nèi)傳遍全場(chǎng)。幾乎所有冠狀病毒中，N蛋白在疾病診斷與防治、致病機(jī)制的研究等方面都發(fā)揮著重要作用，因?yàn)楣跔畈《镜腘蛋白具有一些特殊的功能，如可引起機(jī)體最早期的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在感染初期機(jī)體便可產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體，為疾病的診斷以及疫苗的研制提供有利條件;N蛋白氨基酸序列中含有特殊的亞細(xì)胞定位信號(hào)，且在不同病毒種類(lèi)中此序列不同，

3、可根據(jù)此信號(hào)研究N蛋白在宿主細(xì)胞中的定位特征，為冠狀病毒致病機(jī)制的研究提供了可能。本實(shí)驗(yàn)以PEDV N蛋白為研究對(duì)象，構(gòu)建N基因的重組真核質(zhì)粒，對(duì)表達(dá)的重組N蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)N蛋白的亞細(xì)胞定位特征進(jìn)行研究，以期為PEDV的早期診斷方法的建立及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)主要從以下四個(gè)方面開(kāi)展研究，并取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　(1)N基因重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建。本研究依據(jù)PEDV CV777株N基因的全序列設(shè)計(jì)引物，在

4、擴(kuò)增出目的基因之后與真核載體pPM-C-His連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPM-C-His-N，并利用菌液PCR、雙酶切鑒定以及測(cè)序分析對(duì)構(gòu)建的真核質(zhì)粒進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果均符合預(yù)期，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，為后續(xù)利用該重組質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究提供物質(zhì)材料。
　　(2)重組質(zhì)粒在Vero細(xì)胞中表達(dá)情況的鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，并設(shè)置空載體對(duì)照組和陰性對(duì)照組，24h后提取細(xì)胞總RNA，并于轉(zhuǎn)染后24h、48h、60h分別提取細(xì)胞總蛋

5、白，檢測(cè)重組質(zhì)粒在基因水平和蛋白水平的表達(dá)情況;在轉(zhuǎn)染48h之后利用間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence assay,IFA）檢測(cè)N蛋白在細(xì)胞中的分布。瓊脂糖凝膠電泳與SDS-PAGE結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的細(xì)胞在目的片段大小處均出現(xiàn)了條帶，并且在整個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)了特異性綠色熒光，而對(duì)照組未出現(xiàn)，說(shuō)明該重組質(zhì)粒在基因水平與蛋白水平成功表達(dá)，且能夠在Vero細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。
　　(3)重組質(zhì)粒對(duì)小鼠

6、免疫水平的影響研究。將真核質(zhì)粒免疫昆明系小鼠，同時(shí)設(shè)置空載體對(duì)照組和陰性對(duì)照組;三免過(guò)后采集免疫血清，對(duì)三次采集的血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，并利用Western blotting對(duì)重組質(zhì)粒的反應(yīng)原性進(jìn)行檢測(cè);在無(wú)菌環(huán)境中制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，測(cè)其OD570nm值，用SPSS23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分析真核質(zhì)粒對(duì)小鼠細(xì)胞免疫水平的影響。ELISA結(jié)果顯示小鼠三免抗體效價(jià)達(dá)到1∶51，200，Western blotti

7、ng結(jié)果顯示在目的條帶大小處出現(xiàn)免疫印跡，而淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)顯示重組質(zhì)粒組淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，而空白對(duì)照和陰性對(duì)照組差異不顯著，表明了重組真核質(zhì)粒pPM-C-His-N具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，且可以顯著提高小鼠細(xì)胞免疫水平，為疾病的診斷以及疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。
　　(4)N蛋白對(duì)Vero細(xì)胞的影響研究。為了研究N蛋白亞細(xì)胞定位特征以及對(duì)Vero細(xì)胞的影響，根據(jù)其它冠狀病毒N蛋白亞細(xì)胞定

8、位研究的報(bào)道，首先利用生物信息學(xué)軟件對(duì)PEDV N蛋白NLS序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的核定位基序pat7，位于堿性氨基酸富集區(qū)，且表現(xiàn)出了與其他冠狀病毒同樣高的親水性，說(shuō)明此基序是一個(gè)潛在的亞細(xì)胞定位信號(hào)，為PEDVN蛋白定位特征的研究提供可能。然后利用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，制片之后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并分析N蛋白的定位特征;同時(shí)待轉(zhuǎn)染48h之后固定用PI染色，進(jìn)行流式細(xì)胞分析其對(duì)Vero細(xì)胞周期的影響;結(jié)果顯示N蛋白主要定