miRNA-451表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其對iNOS基因表達的抑制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構(gòu)建miRNA-451真核表達重組質(zhì)粒及其對照重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染小鼠腎小球系膜細胞,研究miRNA-451對腎小球系膜細胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因表達的影響。
　　 方法：依據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫中mlnu-miR-451序列,添加酶切位點及polyT轉(zhuǎn)錄終止序列,設(shè)計兩條寡核苷酸片段,退火處理后克隆至真核表達載體pGenesil-1質(zhì)粒中,經(jīng)酶切鑒定及測序驗證后,構(gòu)建成為miRNA-451真核表達載體(pGene

2、sil-1-miRNA-451質(zhì)粒)。同時同法設(shè)計一對隨機對照單鏈寡核苷酸片斷構(gòu)建成為陰性對照重組質(zhì)粒(pGenesil-1-control)。將pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control質(zhì)粒用lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染小鼠腎小球系膜細胞,經(jīng)G418篩選,建立穩(wěn)定表達pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control的細胞株。采用MTT比色法檢測活細胞數(shù)并繪

3、制生長曲線；RT-PCR、Westernblot及免疫細胞化學(xué)檢測轉(zhuǎn)染前后iNOS基因蛋白質(zhì)表達水平,運用生物學(xué)軟件分析圖像結(jié)果。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定及測序證實pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。與未處理的小鼠腎小球系膜細胞和穩(wěn)定表達pGenesil-1-control的細胞相比,在穩(wěn)定表達pGenesil-1-miRNA-451的小鼠腎小球系膜細胞中,細胞增殖受到

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