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1、目的:構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的RNA干擾(RNAi)表達(dá)載體,并探討該表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中hTERTmRNA表達(dá)的特異性抑制作用,為蛋白水平及細(xì)胞水平的進(jìn)一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究不僅為針對(duì)hTERT基因的RNA干擾提供新的有效的作用靶位,而且為體內(nèi)表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾作為一種有效的基因沉默技術(shù)的應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為針對(duì)端粒酶的乳腺癌基因治療提供新的途徑,同時(shí)也對(duì)RNAi在腫瘤研究和基因治療方
2、面應(yīng)用的可能性進(jìn)行有益的探索。 方法:設(shè)計(jì)針對(duì)hTERT基因的干擾靶序列TGTFCAGCGTGCTCAACTA,合成具有該靶序列短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩條寡核苷酸,其排列順序?yàn)锽amHⅠ酶切位點(diǎn)、19nt正義序列、9ntloop序列、19nt反義序列、RNA聚合酶Ⅲ終止子(6個(gè)T)、SalI酶切位點(diǎn)、HindⅢ酶切位點(diǎn)。合成后經(jīng)退火形成雙鏈DNA。將pGenesil-1表達(dá)載體經(jīng)BamHI、HindⅢ雙酶切后電泳分離,純化回收4800bp
3、左右的大片段。將退火形成的雙鏈DNA通過(guò)T4DNA連接酶連接到線性化pGenesil-1質(zhì)粒U6啟動(dòng)子下游,構(gòu)建重組siRNA表達(dá)質(zhì)粒pGenesil-hTERT。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5a,經(jīng)Kanar抗性篩選,挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)增,并抽提純化質(zhì)粒,然后將抽提的重組質(zhì)粒分別做PstI和SalI單酶切和瓊脂糖電泳分析,同時(shí)做測(cè)序鑒定以確定插入的干擾片段準(zhǔn)確無(wú)誤,即針對(duì)hTERT基因的siRNA表達(dá)載體
4、構(gòu)建成功。同時(shí)完成不針對(duì)任何基因的陰性對(duì)照重組質(zhì)粒的構(gòu)建。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),于轉(zhuǎn)染前一日接種于6孔板中,并設(shè)置空白組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組及pGenesil-hTERT組。以每孔脂質(zhì)體7.5μl、重組質(zhì)粒3μg配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,加入各孔MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體組用無(wú)菌水代替質(zhì)粒,空白組不加任何試劑),轉(zhuǎn)染后48h重組質(zhì)粒上帶有的EGFP基因得以表達(dá),熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞所占比例,以此
5、來(lái)判斷轉(zhuǎn)染效率。接著用TRIzol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA,并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA樣本的濃度、純度以及完整性。以各組總RNA為模板,β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行兩步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),瓊脂糖凝膠電泳分析,并用灰度半定量檢測(cè)各組hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用多樣本均數(shù)兩兩比較的方差分析。 結(jié)果:①pGenesil-1質(zhì)粒經(jīng)BamHI+HindⅢ雙酶切
6、后電泳可見(jiàn)4800bp左右的線性化質(zhì)粒條帶。②對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PstI和SalI單酶切鑒定,酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分析顯示:重組質(zhì)粒因其PstI酶切位點(diǎn)被插入的目的基因片段取代,故無(wú)法被PstI酶切,但由于在插入的目的基因片段里設(shè)計(jì)了一個(gè)SalI酶切位點(diǎn),因此被SalI酶切后可見(jiàn)一條約400bp的DNA條帶。同時(shí)測(cè)序鑒定也證實(shí)目的序列已準(zhǔn)確插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn),重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。③轉(zhuǎn)染后48h熒光顯微鏡下觀察,根據(jù)發(fā)綠色熒光的MCF-7細(xì)胞所占比率判斷
7、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上。④轉(zhuǎn)染48h后各組總RNA提取樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定,濃度為0.7~3.0μg/μl,純度OD260/OD280為1.7~1.9,符合逆轉(zhuǎn)錄要求。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S和5SrRNA三條帶,其中前兩者更清晰,且28S的亮度是18S的2倍左右,表明提取總RNA樣品可用作RT-PCR擴(kuò)增模板。⑤RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析顯示:各組泳道中內(nèi)
8、對(duì)照β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(546bp)的亮度相似,而hTERT擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(111bp)的亮度pGenesil-hTERT組明顯弱于其它三組?;叶葤呙璋攵拷Y(jié)果顯示,pGenesil-hTERT組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體組和空白組MCF-7細(xì)胞中hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.188±0.020、0.737±0.009、0.733±0.015、0.753±0.014。經(jīng)q檢驗(yàn)方差分析,pGenesil-hTERT組hTERTm
9、RNA相對(duì)表達(dá)量分別與空白組、脂質(zhì)體組及陰性對(duì)照組相比,均下降75%左右,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而其它三組之間相比,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論:①設(shè)計(jì)合成的shRNA干擾序列準(zhǔn)確無(wú)誤地克隆到pGenesil-1表達(dá)載體中,針對(duì)hTERT基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。該載體的構(gòu)建可為深入研究端粒、端粒酶在腫瘤細(xì)胞中的作用提供新的手段。②應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑能高效地將重組載體轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞,從而保證了重
10、組載體在細(xì)胞內(nèi)高效地表達(dá)。③針對(duì)hTERT基因的RNAi靶序列設(shè)計(jì)有效,針對(duì)該靶序列構(gòu)建的RNAi體內(nèi)表達(dá)載體在mRNA水平有效并特異性地抑制了MCF-7細(xì)胞中hTERT的表達(dá),與反義核酸技術(shù)相比,抑制效果明顯提高,因此運(yùn)用體內(nèi)表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)是高效可行的方法。④由于hTERTmRNA的表達(dá)與端粒酶活性相關(guān),實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的siRNA體內(nèi)表達(dá)載體在顯著抑制hTERTmRNA表達(dá)的同時(shí)必然下調(diào)端粒酶活性,從而抑
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