重組乳腺癌EZH23’UTR慢病毒載體構(gòu)建及其在MCF-7細胞中穩(wěn)定表達.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶人 EZH23'非翻譯區(qū)（3'UTR）的Ctx-慢病毒篩選載體（Ctx-pLV）并實現(xiàn)該重組體在人乳腺癌 MCF-7細胞中穩(wěn)定整合。
　　方法：1、提取組織總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），獲得目的片段 EZH23'UTR，回收純化；以 T4連接酶連接目的片段與克隆克隆 pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，菌落PCR鑒定重組克隆；抽提重組克隆質(zhì)粒DNA，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和B

2、amHⅠ對其進行酶切鑒定陽性克隆；對鑒定出的陽性重組質(zhì)粒（Amp+）培養(yǎng)基上，抽提質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ對其和Ctx-慢病毒載體雙酶切，分別回收純化，得到目的片段EZH23'UTR和慢病毒雙粘性質(zhì)粒，以T4連接酶將二者連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，提取重組病毒載體質(zhì)粒DNA，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切篩選鑒定陽性重組慢病毒質(zhì)粒Ctx-pLV-EZH23′UTR。3、將重組慢病毒質(zhì)粒Ctx-pLV-EZH23′UT

3、R和輔助包裝系統(tǒng)共感染293T細胞，48小時后收集病毒顆粒，根據(jù)慢病毒載體上的CMV啟動子表達量檢測病毒滴度。使病毒顆粒感染乳腺癌 MCF-7細胞后，通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定整合的乳腺癌細胞，抽提細胞的基因組，用 Real-Time PCR檢測 Ctx-pLV-EZH23′UTR是否整合入細胞MCF-7中。
　　結(jié)果：1、進PCR擴增后得到大小約為275bp的目的片段，與預(yù)計擴增的目的片段大小一致。2、目的片段與線性慢病毒載體定向連接

4、后，對陽性重組子進性菌落PCR鑒定和測序結(jié)果證實，目的片段成功構(gòu)建慢病毒載體上。3、實時熒光定量PCR檢測病毒滴度為4.3×109copy/ml。篩選穩(wěn)定整合MCF-7細胞的最佳濃度為0.2μg/ml。重組病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo) MCF-7后，Real-Time PCR檢測 EZH23'UTR成功整合到乳腺癌MCF-7細胞中。
　　結(jié)論：成功獲得目的片段EZH23′UTR；成功構(gòu)建MiRNA文庫篩選用Ctx-pLV-EZH23′UTR，并實