ROS在戊地昔布誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,居女性癌癥死因第二位。大量流行病學(xué)數(shù)據(jù)和實驗顯示非甾體類抗炎藥可降低乳癌發(fā)病率。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶-2(COX-2)在人類所生長的許多惡性腫瘤中呈現(xiàn)過度表達的，許多專家猜測，COX-2可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過程中，起著至關(guān)重要的作用，研究顯示COX-2選擇性抑制劑塞來昔布可抑制大鼠乳癌細胞增生，非甾體類抗炎藥物除了抑制COX-2外，還可直接靶向調(diào)控其他信號通路，如阻斷PI3K/Akt通路。戊地昔布是

2、第二代COX-2選擇性抑制劑，對COX-1抑制作用輕，引起的胃腸道等不良反應(yīng)輕微，對胃癌和肺癌等有明顯的抑制作用。這些關(guān)于COX-2的研究均表明:假如COX-2呈現(xiàn)的是高表達，那么通過應(yīng)用COX-2抑制劑，可以起到抑制腫瘤的生長和增殖的作用，從而增強化療藥物和放療的敏感性。目前多數(shù)研究均認為COX-2抑制劑主要通過抑制其活性發(fā)揮抗腫瘤作用，但也有一些研究認為通過非COX-2依賴途徑。ROS在腫瘤發(fā)生過程中起雙重作用，盡管ROS可通過造成

3、DNA損傷和激活癌基因的方式促進癌癥發(fā)生，但ROS的增高也是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的原因之一。戊地昔布是選擇性COX-2抑制劑，ROS在戊地昔布抗腫瘤中的作用尚未有報道。在此基礎(chǔ)上，本研究主要探討戊地昔布是否通過調(diào)控ROS誘導(dǎo)人乳腺癌細胞的凋亡。
　　方法:
　　1.細胞的培養(yǎng)
　　所應(yīng)用的細胞為人乳腺癌細胞株MCF-7細胞，應(yīng)用的培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清的改良型RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度是37℃，并且在5％CO2飽

4、和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
　　2.應(yīng)用MTT法檢測各實驗組MCF-7細胞株的生長抑制情況，計算細胞增值抑制率。并檢測N-乙酰半胱氨酸，caspase3抑制劑Ac-DEVD-CHO，caspase抑制劑Z-VAD-FMK對戊地昔布作用的影響。
　　3.流式細胞儀檢測不同濃度的戊地昔布對MCF-7細胞的凋亡率的影響。
　　收集細胞，約106個/組，PBS洗3次，70％預(yù)冷的乙醇固定，PI染液（含質(zhì)量濃度50 mg·L-1的

5、PI，體積分數(shù)1.0％的TritonX-100和質(zhì)量濃度10 mg·L-1RNaseA)，4℃避光染色30 min，流式細胞儀分析結(jié)果。
　　4.Hoechest染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡，用JC-1試劑盒檢測戊地昔布對線粒體膜電位的影響，應(yīng)用活性氧檢測試劑盒在激光共聚焦顯微鏡下檢測ROS水平。
　　5.Western blotting免疫印跡方法測定各個實驗組caspase-3，cleaved-caspase-3

6、，bax和bcl-2蛋白表達變化情況，用近紅外雙色激光成像系統(tǒng)分析軟件掃描并分析。
　　結(jié)果:
　　1.我們用MTT方法檢測了不同濃度戊地昔布（濃度分別為:0，25，50，100，200，400μmol·L-1）作用24h、48h、72h后，對MCF-7的生長抑制率進行了對比，不同濃度戊地昔布作用不同時間后對MCF-7的生長抑制作用，戊地昔布可明顯抑制MCF-7細胞的增殖，且隨時間的延長和濃度的增加，抑制作用顯著。
　

7、　2.我們用流式細胞儀檢測了0，50，100，200μmol·L-1戊地昔布作用48h后對MCF-7凋亡率的作用。其凋亡率分別為:1.29％、8.53％、15.23％、30.21％。結(jié)果表明，戊地昔布可明顯誘導(dǎo)MCF-7凋亡，而且，隨著濃度增加，凋亡率明顯增加(P＜0.05)。
　　3.在激光共聚焦顯微鏡下觀察，應(yīng)用hoechst33258染色檢測戊地昔布誘導(dǎo)的人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響，激光共聚焦顯微鏡下正常細胞核被染成彌

8、散均勻的藍色，呈圓形。戊地昔布作用后，細胞核染色質(zhì)濃縮，熒光增強，并呈典型的凋亡形態(tài)，可見染色質(zhì)邊聚，形成新月狀，MCF-7細胞會出現(xiàn)凋亡，并且應(yīng)用濃度越大，細胞凋亡率越高。
　　4.激光共聚焦顯微鏡下直接觀測應(yīng)用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1），實驗結(jié)果顯示，在對照組中我們可以看到很明顯的紅色熒光，而給予戊地昔布后，紅色熒光減弱，綠色熒光增強，這說明戊地昔布可誘導(dǎo)MCF-7細胞線粒體膜電位明顯降低。
　　5.激光共聚檢測

9、細胞ROS水平，對照組細胞綠色熒光很微弱，給予戊地昔布后可見綠色熒光明顯增強，而且隨著時間延長，綠色熒光強度明顯增加，這就提示給予戊地昔布后可明顯提高細胞內(nèi)ROS水平。給予抗氧化劑N-乙?；腚装彼峥擅黠@阻斷戊地昔布誘導(dǎo)的ROS升高。我們檢測了抗氧化劑N-乙酰基半胱氨酸、caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO、caspase抑制劑Z-VAD-FMK可對戊地昔布作用的影響，結(jié)果表明，均可部分拮抗戊地昔布對細胞的生長作用。
　

10、　6.我們檢測了戊地昔布對caspase-3，cleaved-caspase-3，bax和bcl-2蛋白表達的影響,給予戊地昔布后,隨時間的延長,bax蛋白表達逐漸升高，bcl-2蛋白表達逐漸降低，caspase-3表達先明顯升高，然后降低，降解為cleaved-caspase-3。而在對照組我們檢測不到cleaved-caspase-3的表達，但給予戊地昔布可看到cleaved-caspase-3明顯增多。
　　結(jié)論: