新型砷代謝產(chǎn)物聯(lián)合隱丹參酮對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的:以人乳腺癌細胞株M C F-7為研究對象,研究亞砷酸鈉(iAsm)及其中間代謝產(chǎn)物單甲基亞砷酸(M M Am)二甲基亞砷酸(DM Am)分別與隱丹參酮(CPT)合用后對細胞的作用及其機理。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)M CF-7細胞,取生長良好、狀態(tài)一致的對數(shù)生長期MCF-7細胞,先用M TT比色法檢測不同濃度的無機砷及其中間代謝產(chǎn)物以及隱丹參酮分別在處理M CF-7細胞后檢測細胞的活力和存活率,并根據(jù)上述實驗的結果篩選無機砷及其中

2、間代謝產(chǎn)物的作用濃度和隱丹參酮的作用濃度范圍,確定將無機砷以及其中間代謝產(chǎn)物的濃度定制為1|uM,隱丹參酮的濃度范圍為10?20|u M。再用M T T比色法檢測無機砷及其中間代謝產(chǎn)物和隱丹參酮合用處理M CF-7細胞后細胞的活力和生長,選取藥物的最適宜濃度(砷代謝產(chǎn)物濃度為1 I^M和隱丹參酮濃度為15^M)作為細胞的處理終濃度。并將M C F-7細胞隨機分為八組(C o n組,CPT組,iA s111組,iA sm+CPT組,M M

3、 A111組,M M A m+CPT組,D M A111組,DMAm+CPT組),加入濃度為1|uM的相對應無機砷(iAsm)及其中間代謝產(chǎn)物(M M Am、DM A111)和濃度15^ M的隱丹參酮(CPT),處理不同時間后,通過流式細胞術、W estem-blot、免疫熒光共聚焦等方法檢測不同砷劑與隱丹參酮合用后對M CF-7細胞的凋亡作用,并根據(jù)實驗結果選取其中對M CF-7細胞作用最明顯的一組進行研究其作用機制。
　　結果

4、:M TT法檢測出在低濃度藥物的情況下(砷代謝產(chǎn)物濃度低于5^M,隱丹參酮濃度低于15^M),單用無機砷(iA s m)及其代謝產(chǎn)物(MMAm、DMAm)和隱丹參酮(CPT)分別處理MCF-7細胞時,細胞的存活率沒有明顯的降低。而在高濃度的情況下(砷代謝產(chǎn)物濃度高于5^M,隱丹參酮濃度高于20^M),細胞有明顯的死亡。然而當用低劑量的無機砷和其代謝產(chǎn)物(濃度1|uM)與隱丹參酮(15|uM)聯(lián)合處理MCF-7細胞后,細胞的存活率有明顯的

5、變化。其中以M M Am與 CPT合用效果最為明顯,其抑制率相當于C o n組的5-7倍。用流式細胞術檢測細胞24 h的凋亡率得出M M A m與 C P T合用時,凋亡率達到34.84±3.423％,而 iA sm、MMA111、DMA111、CPT單用以及iAsm和DMAm分別和CPT合用的凋亡率則無明顯變化。在經(jīng)過M M A111與 C P T同時處理24 h后,W estern b lo t法檢測結果顯示,線粒體的促凋亡蛋白Ba

6、k、B ax從細胞漿中向線粒體轉(zhuǎn)移,并且誘導了大量的Cytochrome C從線粒體中釋放到胞漿里。而凋亡相關蛋白P A R P、Caspase9也被活化,其裂解片段增多,而其他實驗組或?qū)φ战M則無明顯的改變。因此,我們以對細胞作用最為明顯的實驗組MMAm+CPT組來探討其誘導凋亡的相關機制。首先,通過Western blot我們檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白PERK、A S K1以及其下游蛋白ATF4、CHOP和JN K等變化,發(fā)現(xiàn)PERK、

7、ASK1被激活,磷酸的PERK、ASK1都有一過性的升高,并在6 h處最為明顯,其下有蛋白ATF4、C H O P和JNK都有上升的趨勢。隨后我們又檢測M APK信號通路相關蛋白,我們發(fā)現(xiàn)E r k與 P38在藥物處理24 h時其磷酸化的形式才有明顯的變化。然后給予J N K抑制劑(SP600125,濃度25^ M)預處理45 m in,結果顯示,MMAm與 CPT聯(lián)合的作用被JN K抑制劑抑制,凋亡相關蛋白PARP、Caspase9的

8、裂解片段也有明顯的減少。進一步給予C a s p a s e酶抑制劑（Z-V A D-F M K,濃度10|u M)預處理30 m in時,發(fā)現(xiàn)C aspase酶抑制劑則作用相對J N K抑制劑較弱。最后,通過流式細胞術檢測12 h細胞內(nèi)活性氧的變化,我們發(fā)現(xiàn)提前1.5 h給予NAC(濃度2 m M)處理之后然后再給予MMAm與 CPT聯(lián)合處理時ROS產(chǎn)生有明顯減少;隨后我們用免疫熒光共聚焦檢測12 h的ROS與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的共定位情

9、況,結果顯示,加藥組中R O S與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體都有良好的共定位;同時W estern b lo t法檢測結果顯示,細胞在給予NAC、MMAm與 CPT處理24 h之后,其凋亡相關蛋白P A R P、Caspase9活化被抑制,其裂解片段也明顯減少,而其他藥物的合用或單用則無明顯的效果。
　　結論:通過以上實驗結果,我們得出無機砷(iA s m)及其中間代謝產(chǎn)物單甲基亞砷酸(M M Am)、二甲基亞砷酸(DM Am)以及隱丹參酮(