TNF-α基因siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其基因沉默效應(yīng)的研究.pdf

1、研究背景：
　　 肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis,PF)的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚,它是多種細(xì)胞因子及其網(wǎng)絡(luò)共同參與的疾病,以肺組織的慢性炎癥、膠原沉積、肺組織結(jié)構(gòu)重塑和慢性纖維組織增生為病理特征,最終可導(dǎo)致呼吸功能衰竭而死亡。肺間質(zhì)纖維化臨床變數(shù)大,預(yù)后差,特別是特發(fā)肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF),確診后平均存活時間不超過3-5年,目前多采用西藥治療,傳統(tǒng)

2、的治療藥物是糖皮質(zhì)激素,或聯(lián)合免疫抑制劑,但治療的有效率低及副作用大,多數(shù)患者耐受性差,難以長期堅持使用;抗氧化劑、蛋白酶抑制劑、基因治療及中醫(yī)中藥治療等治療方法,尚無充分的臨床數(shù)據(jù)支持,仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。目前有效治療手段的缺乏及發(fā)病率的不斷增加給國家、社會和個人造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān),因此,尋找肺間質(zhì)纖維化的有效治療手段迫在眉睫。
　　 近年來,隨著肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制研究的不斷進(jìn)行和深入,諸多關(guān)于調(diào)控、啟動和促進(jìn)肺間

3、質(zhì)纖維化的機(jī)制不斷涌現(xiàn)。許多研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming grow factor-β1,TGF-β1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。
　　 生物醫(yī)學(xué)的研究表明,人類疾病的發(fā)生、發(fā)展都直接或間接與基因有關(guān)。RNA干擾技術(shù)是利用與靶基因同源的雙鏈RNA(double strand RNA,ds RNA)誘導(dǎo)靶基因mRNA降解

4、從而引起特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾技術(shù)的有效載體是小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),因此,siRNA和RNAi的研究和應(yīng)用,均具有重要的意義,有可能成為疾病基因靶向治療的工具和手段。
　　 目的：
　　 構(gòu)建針對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因的小干擾RNA(siRNA)真核表達(dá)載體,觀察載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對人肺腺癌A549細(xì)胞中TNF-α基因表達(dá)的沉默效應(yīng),探索肺間質(zhì)

5、纖維化基因靶向治療的可能性。
　　 材料與方法：
　　 1.依據(jù)GenBank中人TNF-α(NM000594)序列和Clontech公司的RNAiDesigner軟件靶序列設(shè)計原則,設(shè)計并體外合成一對針對TNF-α的特異性序列(siTNF)和一對無關(guān)序列(siCon)。退火合成DNA雙鏈,再分別重組入pRNAT-U6.1表達(dá)載體,經(jīng)過PCR擴(kuò)增鑒定,并送上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序鑒定。
　　 2.將構(gòu)建

6、好的重組載體(pRNAT-U6.1-siTNF、pRNAT-U6.1-siCon)及空載體(pRNAT-U6.1)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞株,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。
　　 3.以未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siCon組和轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1組作為對照,分別采用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot方法檢測細(xì)胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　 4.數(shù)據(jù)應(yīng)用S

7、PSS17.0進(jìn)行分析,統(tǒng)計方法為單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.確定siTNF和siCon的基因序列,兩端分別加入BamHⅠ和HindⅢ的酶切殘基,并體外成功合成編碼TNF-α基因的DNA寡聚核苷酸單鏈。
　　 2.PCR和DNA測序鑒定證實(shí)退火片段插入pRNAT-U6.1,并且與設(shè)計序列完全一致。
　　 3.轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siTNF的A54

8、9細(xì)胞中TNF-α和TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平,與未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siCon和轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1的人肺腺癌A549細(xì)胞比較均顯著降低(P＜0.05),而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siCon細(xì)胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)水平無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 成功設(shè)計并成功構(gòu)建出針對TNF-α基因的siRNA真核表