2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景和目的: 卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤,是臨床上難治性腫瘤之一,由于位置深居盆底,缺乏早期癥狀和體征,75﹪-80﹪的患者確診時已屬晚期,造成卵巢癌診斷和治療上的困難。因此,卵巢癌是死亡率最高、危害最大的婦科惡性腫瘤。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是一種細胞膜脂類衍生物,近年來研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血漿及腹水中LPA水平明顯升高,體外實驗證明降低LPA水平可以抑制卵巢腫瘤細胞增殖,促進其凋亡。

2、LPA可促進卵巢癌細胞的增殖、生存、蛋白酶的產(chǎn)生和激活、促進血管生成因子等細胞因子的生成,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸滑、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。因而影響LPA的產(chǎn)生、代謝、受體表達及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有重要意義,有可能成為卵巢癌治療的一種新途徑。 溶血磷脂酸即1-脂酰甘油3-磷酸酯(1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate),其基本結(jié)構(gòu)包含磷酸基、甘油骨架及長鏈脂肪酸三部分。LPA是一種脂類小分子物質(zhì),是膜

3、來源的具有生物活性的脂類遞質(zhì),為脂質(zhì)代謝的一個中間產(chǎn)物,有細胞間信號傳導(dǎo)作用。LPA主要通過其受體即G蛋白受體介導(dǎo)的多種信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮其多樣的生物學(xué)效應(yīng)。目前已知的人類LPA受體有三種,即內(nèi)皮分化基因蛋白(endothelial differentiationgene,Edg)Edg2,Edg4,Edg7。其中Edg2在正常卵巢細胞、永生化的卵巢細胞中均穩(wěn)定表達,Edg4和Edg7則在卵巢癌細胞過表達,在正常卵巢細胞、永生化的卵巢細胞

4、不表達或低表達。因此,Edg4和Edg7的表達可能與LPA對腫瘤的作用有關(guān)。 近幾年來興起的RNA干擾技術(shù),為腫瘤的分子生物學(xué)治療開辟了新的途徑。與傳統(tǒng)基因沉默技術(shù)相比,RNA干擾技術(shù)具有效果強、持續(xù)時間長等優(yōu)勢,目前這一技術(shù)已在腫瘤的基因治療方面顯示出誘人的前景。本實驗擬構(gòu)建針對LPA受體Edg4的siRNA重組載體,將siRNA對應(yīng)的DNA發(fā)卡樣雙鏈序列克隆入載體內(nèi),轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細胞,在細胞內(nèi)表達Edg4靶向的siR

5、NA分子,特異性沉默Edg4基因,從而阻斷LPA的作用,抑制卵巢癌細胞的生長,為卵巢癌的基因治療尋找新的方法和靶點。方法依據(jù)GenBank中Edg4基因(NM_004720)的序列,遵循h(huán)ttp://www.a(chǎn)mbion.com/tec hlib/misc/siRNA-design.html原則進行設(shè)計,對候選序列通過美國生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)的在線

6、同源序列檢索http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast,選擇確定19個堿基的siRNA靶序列。分別合成2對靶向Edg4siRNA序列,退火成雙鏈DNA,克隆入pGEM-T Easy載體,利用Q互補和T7/SP6 PCR擴增篩選鑒定重組子pGEM-T-siEdg4-1和pGEM-T-siEdg4-2;用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切重組子和siRNA表達載體pRNAT-U6.1;將雙粘Edg4發(fā)卡樣siRN

7、A片段亞克隆入siRNA表達載體pRNAT-U6.1中;利用通用引物篩選鑒定重組子pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2;對插入序列進行DNA序列分析。將siRNA表達載體pRNhT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2轉(zhuǎn)染入人卵巢癌細胞系SKOV3中,利用熒光顯微鏡觀察SKOV3細胞中的轉(zhuǎn)染情況;用熒光定量PCR方法檢測細胞Edg4mRNA表達水平。 結(jié)果:

8、 1.針對Edg4 siRNA得到20個候選靶區(qū)段,對上述候選序列通過美國生物技術(shù)信息中心的在線同源序列檢索,最后確定212-230位(GACCATCGGCTTCTTCTAT)和323-341位(GACCAATCTGCTGGTCATA)為siRVA靶序列。 2. siRNA發(fā)卡DNA退火后,電泳可見明亮條帶,位于約70bp處,與設(shè)計完全一致。 3.退火產(chǎn)物與pGEM-T Easy連接后,轉(zhuǎn)化JM109,篩選鑒定后

9、得到重組子pGEM-T-siEdg4-1和pGEM-T-siEdg4-2。 4.亞克隆后,用通用引物對重組質(zhì)粒進行鑒定,得到pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2。 5.對重組子pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2插入片段DNA序列測序,結(jié)果與設(shè)計完全一致。 6.轉(zhuǎn)染48小時后用熒光顯微鏡觀察卵巢癌細胞可看見大量GFP表達,經(jīng)G41

10、8篩選轉(zhuǎn)染細胞得到對其有抗性的細胞群落。 7.轉(zhuǎn)染Edg4靶向siRNA(pRNAT-U6.1-siEdg4-1,pRNAT-U6.1-siEdg4-2)的實驗組卵巢癌細胞中Edg4 mRNA表達水平明顯降低。而兩個對照組(空白對照組和空載體對照組)卵巢癌細胞系SKOV3細胞中都存在較高水平的Edg4 mRNA表達。 結(jié)論: 1.設(shè)計出針對Edg4的發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸片段。 2.成功‘構(gòu)建出針對Edg4的s

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