4個沉默雞Ii基因慢病毒載體的構(gòu)建及其效果比較.pdf

1、恒定鏈（invariant chain，Ii）是脊椎動物重要的免疫分子，在MHC遞呈抗原中起重要作用。但是對Ii的研究主要集中于人和小鼠，而雞Ii的研究相對滯后。近年發(fā)展的RNA干擾技術(shù)是一種強(qiáng)大的基因功能研究工具，被廣泛的應(yīng)用于基因功能的研究和基因治療。為研究雞Ii與MHC II類分子的關(guān)系，本實驗利用RNAi技術(shù)構(gòu)建了4個沉默雞Ii的慢病毒重組載體并比較了它們的沉默效率。
　　首先，用自行設(shè)計合成的4個雞Ii基因干擾序列經(jīng)退火

2、形成雙鏈shRNA片段，再將其插入慢病毒載體pLL3.7。應(yīng)用PCR、酶切和測序鑒定后，將正確的重組慢病毒載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞進(jìn)行病毒的包裝，待病毒收獲處理后，再感染雞源巨噬細(xì)胞HD-11，最后用熒光定量PCR檢測雞Ii mRNA的相對表達(dá)水平。
　　測序結(jié)果顯示我們正確構(gòu)建了4個重組慢病毒干擾載體，它們分別被命名為pLL-Ii-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527和p

3、LL-Ii-shRNA539。共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，培養(yǎng)48h能在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達(dá)，說明成功包裝了慢病毒，分別命名為LV-shRNA236、Lv-shRNA376、LV-shRNA527和LV-shRNA539。取48h和72h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)過濾和濃縮后接種293T細(xì)胞，逐孔稀釋法測得病毒滴度為2×107TU/mL；再分別將重組慢病毒接種雞源巨噬細(xì)胞HD-11，培養(yǎng)72h后熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明它們

4、具有感染HD-11細(xì)胞活性，通過計數(shù)熒光細(xì)胞比例得知病毒感染效率達(dá)到95％以上；熒光定量PCR結(jié)果顯示，4種重組慢病毒對雞Ii的mRNA表達(dá)均有沉默效應(yīng)，分別為37%、52%、88%和78%，其中LV-shRNA527的沉默效率最高，能使雞Ii的mRNA表達(dá)量下調(diào)88%。
　　綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了4個重組慢病毒載體，并根據(jù)重組慢病毒載體包裝出了高滴度的慢病毒。這些慢病毒具有感染HD-11的細(xì)胞活性并且感染效率達(dá)到95%以上。