Mir-200家庭慢病毒載體構(gòu)建與表達(dá)檢測及其靶基因驗(yàn)證.pdf

1、第一部分miR-200b/c/429過表達(dá)和敲降載體構(gòu)建及慢病毒包轉(zhuǎn)
　　目的:通過文獻(xiàn)檢索和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)可能調(diào)控棕色脂肪發(fā)育過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子PRDM16的miRNA，為了驗(yàn)證miRNA通過PRDM16對(duì)于棕色脂肪發(fā)育分化的調(diào)控，首先構(gòu)建miRNA的過表達(dá)質(zhì)粒和敲降miRNA表達(dá)的質(zhì)粒。并且通過慢病毒包轉(zhuǎn)驗(yàn)證慢病毒載體的構(gòu)建。
　　方法:1.克隆約500bp的包含miR的前體序列的片段，通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化和測序等

2、獲得重組的miR-200b/c/429過表達(dá)質(zhì)粒。2.根據(jù)miR-200b/c/429的成熟序列設(shè)計(jì)并合成anti-miRNA序列，然后通過克隆的構(gòu)建anti-miR-200b/c/429的重組質(zhì)粒。3.通過三質(zhì)粒體系包裝miRNA的過表達(dá)的慢病毒和敲降的miRNA的慢病毒。
　　結(jié)果:經(jīng)過PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的片段大小約為500bp，經(jīng)過酶切和連接后構(gòu)建出重組質(zhì)粒。陽性克隆測序結(jié)果顯示目的片段正確克隆入載體中。三質(zhì)粒

3、體系構(gòu)建的轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系后48小時(shí)，細(xì)胞顯示綠色熒光。
　　結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了miR-200b/c/429過表達(dá)載體和anti-miR-200b/c/429載體，并且慢病毒包裝成功。
　　第二部分mir-200b/c/429的表達(dá)及其對(duì)靶基因的調(diào)控
　　目的:觀察miR-200b/c/429在高脂誘導(dǎo)老鼠的皮下白色脂肪和3T3-L1細(xì)胞系誘導(dǎo)成熟分化過程中的表達(dá)變化。構(gòu)建包含PRDM16基因3'UTR的雙熒光報(bào)告載

4、體，通過雙熒光素實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-200b/c/429對(duì)于PRDM16基因表達(dá)的調(diào)控。通過通過Q-PCR驗(yàn)證慢病毒干擾敲降3T3-L1中的miR-200b/c/429后，其中的miR-200b/c/429的表達(dá)，并觀察miR-200b/c/429表達(dá)量改變后，在3T3-L1其對(duì)PRDM16表達(dá)的影響。
　　方法:1、用Q-PCR的方法觀察miR-200b/c/429在高脂肪誘導(dǎo)的C57小鼠的皮下白色脂肪中的表達(dá)，以及miR-200b

5、/c/429在3T3-L1前脂肪細(xì)胞系中誘導(dǎo)分化成熟過程中的表達(dá)的變化。4、通過構(gòu)建PRDM16的基因的雙熒光報(bào)告載體，并與miR-200b/c/429過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞系中，觀察熒光表達(dá)的變化。5、通過慢病毒包轉(zhuǎn)后侵染3T3-L1細(xì)胞系，經(jīng)過8天的誘導(dǎo)分化，觀察PRDM16基因的表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:1.成功構(gòu)建了PRDM16基因的3'UTR，并且通過與miR-200b/c/429的共轉(zhuǎn)染，觀察到miR-200b

6、/c下調(diào)了熒光素的表達(dá)，證明miR-200b/c可以調(diào)控PRDM16基因的3'UTR。2.在高脂肪誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠的皮下脂肪中，miR-200b/c的表達(dá)量顯著地下調(diào)，在3T3-L1誘導(dǎo)分化成熟過程中miR-200b/c/429的表達(dá)量顯著性上調(diào)。3.通過慢病毒侵染anti-miR-200b/c/429干擾miR-200b/c/429的表達(dá)后，經(jīng)過誘導(dǎo)分化發(fā)現(xiàn)PRDM16的表達(dá)量上調(diào)。
　　結(jié)論:1.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明mi