針對MTA1 mRNA的siRNA載體構(gòu)建及其對基因沉默作用.pdf

1、背景和目的 惡性腫瘤是臨床上深感棘手的難題，其致死的主要原因是腫瘤細胞發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個涉及多種基因及其產(chǎn)物的復(fù)雜過程，包括腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離，侵入血管、淋巴管，黏附內(nèi)皮細胞而停留在遠隔部位，向外浸潤，誘導(dǎo)新生血管形成，逃避宿主抗腫瘤反應(yīng)和在轉(zhuǎn)移部位生長等過程。因此了解腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移所涉及的基因和基因產(chǎn)物是目前國內(nèi)外一項重要的研究課題。近年來已有很多關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究，以期尋找出安全有

2、效的治療惡性腫瘤的方案，延長惡性腫瘤患者的生存期，改善其生活質(zhì)量。 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(metastasis associated gene 1，MTA1)定位于染色體14q32.3，人MTA1基因編碼分子量為82KD，含715個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)MTAl。MTA1蛋白具有明顯的親水性，不屬于細胞表面蛋白或分泌蛋白。蛋白羧基末端富含脯氨酸，與SH3結(jié)合域完全配對。而SH3在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中參與蛋白和蛋白間相互作用，構(gòu)成細胞骨架組分，

3、并與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中與浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因有關(guān)。MTA1蛋白還具有9個蛋白激C(PKCs)、2個酪氨酸激酶(1Ks)、7個酪蛋白激酶11(CK Ⅱ)的磷酸化位點以及4個N<,2>糖基化位點。說明MTA1蛋白可能在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中與其他一些維持細胞正常功能的蛋白發(fā)生作用。運用Southern blotting分析發(fā)現(xiàn)，MTA1基因在進化當(dāng)中高度保守。MTA1被認為是細胞核小體重構(gòu)和脫乙?；鶑?fù)合物(nucleosome remodeling a

4、nd histone eacetylase，NuRD)的組成部分之一，NuRD具有核小體重構(gòu)與組蛋白脫乙酰酶活性。組蛋白乙?；苓x擇性的使某些染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)由緊密變得松散，開放某些基因的轉(zhuǎn)錄，增強其表達水平，ATP依賴的NuRD的乙?；c脫乙?；砹税私Y(jié)構(gòu)與功能調(diào)整的一般機制。它們通過影響染色質(zhì)的狀態(tài)來調(diào)整轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程，調(diào)控組蛋白脫乙?；鶑亩l(fā)揮其生物學(xué)作用。 目前多數(shù)研究認為MTA1的高表達與一些上皮源性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密

5、切相關(guān)。MTA1可能是通過參與信號傳導(dǎo)與基因表達調(diào)控一系列有關(guān)浸潤轉(zhuǎn)移的蛋白而起重要作用。MTA1基因的作用將為惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控提供一個有效的作用靶點和控制手段。近幾年來興起的RNA干擾技術(shù)，為腫瘤的分子生物治療開辟了新的途徑。與傳統(tǒng)基因沉默技術(shù)相比，具有效果強、持續(xù)時間長等優(yōu)勢，目前這一技術(shù)已在腫瘤的基因治療方面顯示出誘人的前景。本實驗擬構(gòu)建針對MTA1 mRNA的siRNA重組載體，將siRNA對應(yīng)的DNA發(fā)卡樣雙鏈序列克隆入

6、載體內(nèi)，位于H1啟動子下游，轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)表達MTAl靶向的siRNA分子，特異性沉默MTA1的表達。 方法 依據(jù)GenBank中MTA1基因(NM_004689)的序列，利用以下幾個網(wǎng)址提供的設(shè)計分析軟件進行設(shè)計http：//www．a(chǎn)mbion．com/techlib/ misc/siRNA design．html： http：//www2．takara-bio．co．jp/sima-d/top．php。

7、對上述候選序列通過美國生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)的在線同源序列檢索http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast，確定針對MTAl的siRNA序列。合成MTA1發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸，退火成雙鏈DNA，克隆入T載體，利用α互補和T7/SP6 PCR擴增篩選鑒定重組子pGEM-T-MTA1；用BgllI和HindⅢ雙酶切重組子pGEM

8、-T-MTA1和siRNA表達載體pSupemeo；將雙粘MTA1發(fā)卡樣siRNA片段亞克隆入siRNA表達載體PSuperneo中；利用BglⅡ和HindⅢ雙酶切篩選鑒定重組子pSupemeo-MTA1；對插入序列進行DNA序列分析。將siRNA表達載體pSupemeo-MTA1轉(zhuǎn)入人骨肉瘤細胞系MG-63中，用RT-PCR方法檢測細胞MTA1 mRNA表達水平。 結(jié)果 1．得到116個候選MTA1 siRNA靶區(qū)段，

9、對上述候選序列通過美國生物技術(shù)信息中心的在線同源序列檢索，最后確定的編碼序列是19個堿基，GACCCTGCTGGCAGATAAA(即481-499nt)。 2．siRNA發(fā)卡DNA的退火后，電泳可見明亮條帶，位于約70bp處，與設(shè)計完全一致。 3．退火產(chǎn)物與pGEM-T Easy連接后，轉(zhuǎn)化JM109，篩選鑒定后得到重組子pGEM-T-MTA1。 4．亞克隆后，用BglⅡ和HindⅢ雙酶切對重組質(zhì)粒進行鑒定，得到

10、pSupernco-MTA1。 5．對重組子pSupemeo-MTA1插入片段DNA序列測序，結(jié)果與設(shè)計完全一致。 針對WTAl mRNA的siRNA載體構(gòu)建及其對基因沉默作用 6．轉(zhuǎn)染pSuperneo-MTAl的實驗組骨肉瘤細胞中MTAl mRNA表達幾乎完全被抑制，而兩個對照組(無關(guān)siRNA對照組和空載體對照組)和未轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細胞系MG-63細胞中都存在較高水平的MTAl mRNA表達。 結(jié)論