人ELP3基因反義真核表達載體的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、目的：組蛋白甲基化、乙?；缺碛^遺傳修飾對基因表達有重要影響。已有的研究結(jié)果表明，酵母Elongator復(fù)合物作為一個具有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性的復(fù)合體，協(xié)助RNA聚合酶Ⅱ參與GAL1，SSA3等基因的轉(zhuǎn)錄延伸過程。已知人與酵母Elongator復(fù)合物組成高度保守，功能極為相似，其Elp3亞基均是組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性的核心。在體外去除HeLa細胞抽提物中的Elongator復(fù)合物可降低其轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)模板的速率，提供了人Elongator

2、復(fù)合物參與轉(zhuǎn)錄延伸的生化證據(jù)，但目前尚無人Elongator復(fù)合物與其調(diào)控的靶基因方面的報道。本論文的目的是通過構(gòu)建人ELP3基因反義真核表達載體，并轉(zhuǎn)染HeLa細胞，抑制或者阻斷ELP3基因的表達，以研究ELP3基因下調(diào)對HSP70表達的影響，從而了解Elp3及其所在的復(fù)合物是否參與HSP70的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，為深入研究Elongator復(fù)合物的催化亞基Elp3在真核基因表達調(diào)控中的功能奠定基礎(chǔ)，并為探索某些與轉(zhuǎn)錄相關(guān)疾病的發(fā)生機理提供有價

3、值的信息。 方法：選取人ELP3基因三個不同的區(qū)段(HAT區(qū)、非HAT區(qū)、基因全序列)構(gòu)建了反義質(zhì)粒pRS313ah1644、pRS314ah1107、pRS314ah450，通過轉(zhuǎn)入酵母的敏感性實驗和對ELP3及SSA3基因半定量RT-PCR檢測，篩選出抑制作用最為明顯的非HAT區(qū)1107bp片段構(gòu)建了反義真核表達質(zhì)粒pcDKA3ah1107，雙酶切鑒定證實人ELP3基因反義RNA真核細胞表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過脂質(zhì)體將該反義R

4、NA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細胞內(nèi)，以G418篩選陽性細胞克??；同時以脂質(zhì)體攜帶熒光蛋白表達質(zhì)粒pEGFP轉(zhuǎn)染HeLa細胞，并用熒光顯微鏡觀察細胞，評估轉(zhuǎn)染效率。運用Northern blot方法檢測外源導(dǎo)入質(zhì)粒和內(nèi)源ELP3在HeLa細胞中的表達情況；運用RT-PCR和Western blot檢測HeLa細胞中HSPTO在基因和蛋白水平的表達情況。實驗結(jié)果采用SPSS軟件作方差分析(多樣本均數(shù)的兩兩比較)。 結(jié)果：運用酵母功能互

5、補和基因表達分析實驗體系快速篩選出對人ELP3抑制作用最為明顯得非HAT區(qū)1107bp片段；用此片段構(gòu)建哺乳動物細胞反義RNA表達質(zhì)粒pcDNA3ah1107。脂質(zhì)體攜帶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞的效率約在12％左右；在G418篩選轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細胞中，運用Northern blot可檢測到導(dǎo)入的反義質(zhì)粒和空質(zhì)?？稍贖eLa細胞中穩(wěn)定表達；與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組、未轉(zhuǎn)染細胞對照組相比，反義ELP3轉(zhuǎn)染組ELP3 mRNA表達水平顯著下降(P<0.01)

6、，RT-PCR和Western Blot檢測表明，反義轉(zhuǎn)染組HSP70 mRNA和蛋白質(zhì)水平也顯著下降(P<0.01)；而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染細胞對照組的ELP3和HSP70 mRNA及Hsp70蛋白質(zhì)水平均無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：人ELP3基因反義RNA表達質(zhì)粒pcDNA3ah1107可高度抑制人ELP3基因mRNA水平的表達，進而導(dǎo)致HSP70 mRNA和蛋白質(zhì)水平的明顯降低，也即反義質(zhì)粒下調(diào)HeLa細胞ELP