GLT-1基因siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的抑制效應(yīng).pdf

1、谷氨酸(glutamate,Glu)是細(xì)胞外最主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì),使興奮性氨基酸維持在相對(duì)較低的水平,可確保適當(dāng)?shù)男盘?hào)-噪聲比率和防止谷氨酸受體過度激活而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate transporters,Glu Ts)是一種糖蛋白,位于神經(jīng)膠質(zhì)及神經(jīng)元細(xì)胞膜上的,它的主要功能是迅速轉(zhuǎn)運(yùn)突觸間隙中的Glu,保護(hù)神經(jīng)元不受Glu毒性影響和維持突觸間信號(hào)的正常傳遞。癲癇發(fā)作的致病原因很多,主要包括遺傳性、發(fā)育及后天獲得

2、三類。在嚙齒類動(dòng)物模型中,通過基因的敲除或抑制改變了谷氨酸受體或Glu Ts的表達(dá),能夠誘發(fā)或抑制癲癇發(fā)作。GLT-1是Glu Ts的5種亞型之一,它是腦內(nèi)最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白,表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞上。研究發(fā)現(xiàn),癲癇發(fā)作及其易感性的形成與GLT-1的表達(dá)變化有關(guān)。雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種簡便而快速的抑制生物體內(nèi)基因表達(dá)的方法。小干擾R

3、NA(small interfering RNA,siRNA)激活核糖核酸酶對(duì)同源序列mRNA的進(jìn)行特異性降解,從而導(dǎo)致基因沉寂的現(xiàn)象,而產(chǎn)生的表型是相同無效突變體或相似的突變等位基因。特殊形式的基因沉寂還包括植物中的共抑制和真菌中的抑制現(xiàn)象,它還與轉(zhuǎn)座子沉寂,抗病毒防御機(jī)制,基因調(diào)控和染色體變異有關(guān)。大量的分子生化研究表明RNAi誘導(dǎo)的基因沉寂分為兩步,首先,導(dǎo)入細(xì)胞的dsRNA被Dicer酶(RNA酶Ⅲ家族成員)消化成21-23個(gè)核

4、苷酸的siRNA;然后,其與核糖核酸酶等形成RNA誘導(dǎo)沉寂復(fù)合體(RNA induced silencing complex,RISC),對(duì)它的同源基因進(jìn)行酶解。而Dicer酶、RNA依賴的RNA聚合酶、解旋酶和雙鏈RNA內(nèi)切核酸酶在不同的生物體的RNAi中起著重要作用,其中部分還調(diào)控許多非編碼RNA的生物作用,稱為微小RNA(micro-RNA)。微小RNA和RNAi很大程度上在生物合成和功能上相似。最近RNAi方面的研究集中在基因組

5、DNA的甲基化,異染色質(zhì)形式改建和程序DNA的消除。而從其變化來看,基因功能的沉寂效果是嚴(yán)格的。由于RNAi的特異性和高效率,它不僅是功能基因組學(xué)的重要工具,而且有助于相關(guān)基因疾病的診治。
　　目的:利用RNAi技術(shù),以GLT-1為靶基因,設(shè)計(jì)構(gòu)建siRNA真核表達(dá)載體,進(jìn)行測序鑒定,并檢測該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后GLT-1基因表達(dá)情況和對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為進(jìn)一步研究癲癇的發(fā)病機(jī)制提供新的技術(shù)方案和理論依據(jù)。
　　

6、方法:根據(jù)GLT-1基因的序列特點(diǎn)和siRNA的設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)其shRNA的核苷酸片段。退火后將其克隆入pSupressorNeo,構(gòu)建可表達(dá)大鼠GLT-1基因siRNA的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pSuppressorNeo-GLT-1。利用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后,采用RT-PCR,Western-blot及免疫熒光法等方法檢測轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中GLT-1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.所構(gòu)建載體pSuppresso

7、rNeo-GLT-1(Pa,Pb,Pc)經(jīng)限制性酶切鑒定和基因測序證實(shí)為GLT-1 siRNA的真核表達(dá)載體;2.利用成功構(gòu)建的三種siRNA表達(dá)質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體介導(dǎo),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,分別采用RT-PCR、Western-blot和免疫熒光法檢測GLT-1的mRNA及蛋白水平,GLT-1 siRNA真核表達(dá)載體高效而特異地沉默了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中GLT-1基因的表達(dá),但針對(duì)不同部位序列的siRNA真核表達(dá)載體抑制效率不同,以pSupp