NOV基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大鼠真皮多能干細(xì)胞成神經(jīng)分化中的作用研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNs)的損傷修復(fù)一直是困擾神經(jīng)科學(xué)工作者的大難題。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一旦損傷便不能恢復(fù)。近20年來隨著神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展，尤其是干細(xì)胞的出現(xiàn)使人們觀念發(fā)生改變，逐漸認(rèn)識到成年CNS再生是由神經(jīng)元的固有特性(intrinsicproperties)和其所處的環(huán)境(environmentalcues)共同決定的。因此增加受損神經(jīng)元的再生潛能，改善軸突再生的微環(huán)境成為CNS損傷修復(fù)的

2、基點(diǎn)。 神經(jīng)損傷后修復(fù)的難點(diǎn)之一是神經(jīng)元再生困難，近年來隨著干細(xì)胞研究的迅猛發(fā)展，組織和細(xì)胞移植治療成為大家最為關(guān)注的方法之一。選擇合適的種子細(xì)胞是細(xì)胞移植最核心的問題。目前用于移植的細(xì)胞供體主要是胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSC)、來源于神經(jīng)系統(tǒng)的具有促神經(jīng)再生作用的細(xì)胞(如神經(jīng)膜細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞等)，以及其他具有成神經(jīng)分化潛能的成體干細(xì)胞。盡管這些細(xì)胞在CNS損傷修復(fù)移植治療中均顯示

3、出不同程度的積極作用，但由于細(xì)胞來源局限、取材不易、免疫排斥以及倫理道德等諸多方面的問題，臨床應(yīng)用受到很大限制。因此，尋找新的種子細(xì)胞來源成為當(dāng)務(wù)之急。皮膚是人體最大的器官，包括來源于三個胚層的多種不同的組織細(xì)胞，自我更新和再生修復(fù)速度快，是成體干細(xì)胞分離和研究的良好對象。真皮多能干細(xì)胞(Dermalmultipotentstemcells，DMSCs)是一種新近分離成功的具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有分化為脂肪細(xì)胞

4、、肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的能力。相對于其他移植供體細(xì)胞而言，DMSCs具有來源豐富、容易獲得、可自體移植、具有更少的“譜系傾向性”等優(yōu)點(diǎn)。避免了胚胎倫理學(xué)、來源不足、異體排斥等弊端。更有研究表明，DMSCs移植治療脊髓損傷時，不僅能外在補(bǔ)充缺失神經(jīng)元，同時可通過分化產(chǎn)生Schwanncells促進(jìn)軸突再生及髓鞘化。顯示了DMSCs在CNS損傷修復(fù)中的良好應(yīng)用前景，有望成為細(xì)胞移植及組織工程的新寵。 在神經(jīng)損傷修復(fù)中，除細(xì)胞移植外在補(bǔ)充

5、缺失神經(jīng)元外，利用基因工程方法改善損傷局部微環(huán)境是治療的另一個側(cè)重點(diǎn)。腎母細(xì)胞瘤過度表達(dá)基因(NephroblastomaOverexpressiongene，NOV)是1991年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，其所編碼產(chǎn)物(NOV蛋白)是一種胰島素樣生長因子(Insulin-likeGrowthFactor,IGF)相關(guān)蛋白(IGF-relationproteins，IGF-rPs)，屬于IGF超家族的成員。NOV基因是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個調(diào)控因子

6、，與動物CNS的損傷和修復(fù)之間存在一定的關(guān)系。NOV基因可通過IGF依賴或者非依賴的方式發(fā)揮作用，參與CNS損傷后的再生和修復(fù)過程。NOV基因的真核表達(dá)載體可以表達(dá)和釋放NOV蛋白，促進(jìn)內(nèi)源和外源性NSC向神經(jīng)元的分化，為CNS再生修復(fù)提供合適的微環(huán)境。NOV基因及其蛋白對DMSCs是否具有類似作用尚未見相關(guān)報道。 擬將DMSCs作為種子細(xì)胞攜載NOV基因進(jìn)入體內(nèi)，不但能外在補(bǔ)充CNS損傷中缺失的神經(jīng)元，同時在體發(fā)揮改善損傷局部

7、微環(huán)境的生物學(xué)效應(yīng)，結(jié)合NOV基因治療及DMSCs細(xì)胞移植治療雙重優(yōu)勢用于CNS的損傷修復(fù)，是本實(shí)驗(yàn)的基本設(shè)計(jì)思路。 為此本文進(jìn)行了如下研究： (1)含NOV基因的全長序列的真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)； (2)大鼠真皮來源多能干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定； (3)觀察NOV基因及其分泌蛋白對DMSCs增殖和成神經(jīng)分化的影響。通過該項(xiàng)研究為結(jié)合NOV基因工程及DMSCs細(xì)胞移植用于CNS的損傷修復(fù)治療提供初步離體實(shí)

8、驗(yàn)資料。 研究的主要結(jié)果及結(jié)論概述如下： 1、利用RT-PCR的產(chǎn)物，采用定向克隆的方法，通過中間載體pMD-19T，成功地將NOVcDNA全長序列克隆到pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒上，構(gòu)建了pEGFP-N1/NOV融合表達(dá)載體，用抗性菌落篩選、質(zhì)粒酶切鑒定、插入片段序列分析等方法，證明獲得的重組質(zhì)粒完全符合設(shè)計(jì)要求，為進(jìn)一步的NOV基因功能研究提供分子平臺。 2、利用早期貼壁傳代培養(yǎng)方法，從新生大鼠真皮中分離培

9、養(yǎng)多能干細(xì)胞，該細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、MTT法測定生長曲線具有良好的自我增殖能力；在一定誘導(dǎo)條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞，具有向外胚層及中胚層細(xì)胞分化的多能性。由此證實(shí)了大鼠真皮組織中存在著間充質(zhì)干細(xì)胞，為干細(xì)胞移植治療提供了又一新的種子細(xì)胞來源。 3、在構(gòu)建了NOV基因真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法首次將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DMSCs中，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率約30％。經(jīng)G418篩選陽性克隆、多次傳代純化

10、后用RT-PCR法檢測到NOV重組質(zhì)粒在DMSCs中穩(wěn)定表達(dá)。表明DMSCs可作為NOV基因的細(xì)胞載體。 4、通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀及MTT法研究NOV基因轉(zhuǎn)染對DMSCs增殖性的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了NOV基因的DMSCs較對照組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例下降，細(xì)胞倍增時間提前，增殖能力提高一倍。提示NOV基因能刺激DMSCs的增殖。 5、收集培養(yǎng)NOV/DMSCs細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(NOV-CM)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及

11、免疫細(xì)胞化學(xué)法，研究NOV基因及其分泌蛋白對DMSCs分化的影響，結(jié)果顯示NOV-CM可以促進(jìn)DMSCs向神經(jīng)元方向分化，分化細(xì)胞中神經(jīng)元比例增高，且細(xì)胞突起較對照組明顯延長。NOV基因轉(zhuǎn)染亦具有同樣的作用。 綜上所述，我們準(zhǔn)確的構(gòu)建了含NOV基因全長序列的真核表達(dá)載體，成功分離、培養(yǎng)并鑒定了新生大鼠真皮多能干細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，采用脂質(zhì)體法首次將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至DMSCs中，并且NOV基因在其中穩(wěn)定表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明NOV基