小鼠SPK1基因siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建靶向小鼠鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase-1,SPK1)基因的RNA干擾(R NA interference,RNAi)載體并轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer,LLC)細(xì)胞,觀察其轉(zhuǎn)染效果,為進(jìn)一步探索SPK1與非小細(xì)胞肺癌之間的關(guān)系提供一種技術(shù)手段。
　　方法:
　　選取文獻(xiàn)已證實(shí)有效的、針對(duì)小鼠SPK1基因的特異性小干擾RNA(small interfe

2、ring RNA,siRNA)序列,根據(jù)上述序列人工合成模版序列,然后將其和雙酶(AgeI和EcoRI)切后的線性質(zhì)粒載體連接,將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌中,對(duì)在含抗生素的培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對(duì)其進(jìn)行電泳及測(cè)序分析。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用脂質(zhì)體將其導(dǎo)入小鼠Lewis肺癌細(xì)胞中,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光、流式細(xì)胞儀檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率,免疫印跡檢測(cè)SPK1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證,小鼠SPK1