周期型馬來絲蟲多基因克隆及真核載體構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、大部分傳統(tǒng)的寄生蟲疫苗不能阻止寄生蟲感染，這主要是由于寄生蟲具有免疫逃避能力、生活史復(fù)雜、未找到合適抗原、以及免疫機(jī)制未闡明等原因造成的。新出現(xiàn)的DNA疫苗再次燃起了人們對(duì)疫苗抗寄生蟲感染的希望。在過去的十年中，DNA疫苗至少在多種抗寄生蟲感染中獲得了部分成功。抗絲蟲感染的核酸疫苗也得到了研究，目前正在尋找有效抗原。資料表明，pmy、cys、myosin作為抗原均可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。本研究中，根據(jù)Genbank上提供馬來絲

2、蟲的pmy及其部分片段、cys-p、myosin序列，自行設(shè)計(jì)合成引物，采用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增從感染動(dòng)物模型沙鼠體內(nèi)提取的馬來絲蟲的pmy及pmy-N端,cys,myosin基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為2640bp、792p、120lbp、1384bp。電泳鑒定后純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與T載體(pGEM-T，pMDl8-T)連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,藍(lán)白斑法篩選陽性克隆經(jīng)PCR和酶切初步鑒定后，送基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過分析，

3、與Genebank上提供的相應(yīng)序列比較，其結(jié)果同源性分別為99％、98％、98％、99％，從而克隆了目的基因片段。根據(jù)pmy測(cè)序結(jié)果，推測(cè)其氨基酸序列，然后利用相關(guān)軟件預(yù)測(cè)它的B細(xì)胞表位。 在設(shè)計(jì)引物時(shí)，引物中已引入限制性酶切位點(diǎn)，因此，酶切陽性重組質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒，純化酶切片段后，用T4連接酶連接酶切片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選陽性克隆，經(jīng)PCR和酶切鑒定，獲得陽性重組質(zhì)粒，真核載體構(gòu)建成功。大量提取重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA