小鼠IFN-γ真核表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)研究.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文小鼠IFN-γ真核表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)研究姓名：劉康棟申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：趙明耀;董子明20030501鄭州大學(xué)2 0 0 3 年碩士畢業(yè)論文 小鼠I F N —y 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染鼠腹腔巨噬細(xì)胞抗腫癰效應(yīng)研究I 類抗原的表達(dá)。因而可以促進(jìn)T h 細(xì)胞與A P C 以及C T L 與靶細(xì)胞的識別及相互作用。I F N —Y 的表達(dá)對T h 。細(xì)胞的增殖

2、有抑制效應(yīng)，但對T h 。細(xì)胞卻沒有此效應(yīng)，這種差別可能與T h ．細(xì)胞缺失I F N - Y 受體鏈的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。此外I F N —Y對維持幼稚型T 細(xì)胞對I L —1 2 的反應(yīng)是必需的。這有利于T h 。細(xì)胞的分化，從而增強(qiáng)腫瘤的特異性細(xì)胞免疫。I F N - Y 對N K 細(xì)胞有強(qiáng)的激活作用，激活的N K 細(xì)胞可以非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。I F N - Y 在激活巨噬細(xì)胞分泌T N F —Q 的同時，還可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞T N

3、 F —n 受體的表達(dá)。增強(qiáng)T N F _ a 的抑瘤作用，能夠增強(qiáng)靶細(xì)胞對C T L 和N K 細(xì)胞的敏感性。早期將巨噬細(xì)胞體外活化后回輸?shù)襟w內(nèi)治療腫瘤的過程中，I F N —Y 和L P S常被用來作為巨噬細(xì)胞的體外活化因子。但由于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞吞噬活性喪失很快( 每小時約喪失3 ％) ，體外培養(yǎng)體內(nèi)回輸?shù)膽?yīng)用受到限制。治療效果不理想。本實驗構(gòu)建了小鼠I F N —Y 的真核表達(dá)載體，并將此載體在體外轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并在荷

4、瘤小鼠腹腔內(nèi)注射重組表達(dá)載體，觀察抗腫瘤效應(yīng)。實驗方法：I ．小鼠I F N —Y 真核表達(dá)載體的構(gòu)建：無菌收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)于含1 0 ％胎牛血清的R 兩1 1 6 4 0 培養(yǎng)液中( i 0 0 u g ／m I P H A ) 培養(yǎng)4h 。1 0 0 0r p m 離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，按上海生工試劑盒方法提取總R N A 。設(shè)計兩套引物，采用R T —P c R 、巢式P C R 擴(kuò)增提取的總R N A得到I F N —Y

5、 的c D N A ，將此c D N A 和p G E M - T 載體連接，用藍(lán)白篩選的方法初步篩選，用P C R 的方法進(jìn)一步鑒定。將鑒定得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，雙酶切后回收目的片段和雙酶切的p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒相連接，篩選得到重組的真核表達(dá)載體p c D N A 3 ，卜I F N —Y ，質(zhì)粒的提取、純化、感受態(tài)細(xì)胞制備、轉(zhuǎn)染、藍(lán)白篩選均參照《分子克隆實驗指南》進(jìn)行。2 ．小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：取2 0 克