原癌基因Lmo2不同剪接方式的表達質粒的構建及表達.pdf

1、南開大學醫(yī)學院碩士(學位)論文原癌基因Lmo2不同剪接方式的叁竺.透拉的構建及表達專業(yè):臨床醫(yī)學(七年制)研究生:劉隸寧導師:朱天慧中文摘要冬mo:是隸屬于LIM蛋白家族的一個T淋巴細胞白血病原癌基因，研究顯示它與胚胎卵黃囊期紅系發(fā)育、成體血細胞分化相關，并且在血管新生過程中發(fā)揮著重要的作用.以往的工作顯示該基因編碼一個158氨基酸的蛋白質，此蛋白不含結合DNA的結構域，但含有兩個串聯(lián)的特征性LIM結構域.有證據表明LIM結構域可以介導

2、蛋白質之間的相互作用，LM02蛋白作為橋梁分子將其它轉錄調控因子結合到一起，在不同細胞中形成各種不同類型的復合體，進而調節(jié)特定下游靶基因的表達本實驗室的前期工作用正常成人腎組織mRNA為材料，結合新近發(fā)展的SMARTPCR及5RACE技術找到了Lmo2基因的一種新的5剪接模式.克隆到此剪接模式的全長cDNA并進行序列分析，發(fā)現(xiàn)這個新的轉錄本具有與以往不同的轉錄起始點，編碼一個151氨基酸的蛋Il質，N$7個氨基酸序列與原先報道的LM02

3、蛋白有差異，其余則完全相同此外，在人類基因組序列數據庫中檢索Lmo2薈里宜至竺，經過對原先報道的Lmo2mRNA序列修正后，找到符合原讀碼框的更上游的ATG起始密碼，其編碼產物在一直被廣泛認同的LM02蛋白序列的N端增加了69個氨基酸。為進一步認識這兩種新編碼蛋白表達特征及對其潛在結合因子的研究，本論文進行了以F幾個方面的工作:I以本實驗室先前構建的PGEXQ載體為模板PCR，得到了原癌基因Lmo2最短剪接模式Lmo2一的開放讀碼框(O

4、RF)，將其作為插入片斷，利用基因工程方法構建到真核表達載體pcDNAMycHis6B中。此新構建的載體稱為pcDNAMycHis6BLmo2Sa2提取本實驗室先前構建的急性T淋巴細胞白血病細胞系8511的cDNA，以其為模板PCR得到了原癌基因Lmo2最長剪接模式Lmo2L的開放讀碼框(ORF)，將其作為插入片斷，利用基因工程方法構建到原核表達載體pET中。此新構建的載體稱為pETLmo2Lo3對構建的pETLmo2L原核表達系統(tǒng)進行

5、誘導表達，得到了預期大小的目的蛋白。利用組氨酸與Ni“離子的鰲合作用親和層析，純化目的蛋白.關鍵詞Lmo2、原核表達載體匕真核表達載體、一蛋m—一一一一一一一止些F7c竺竺M41全(tx)論文ofLmo2andtheirpotentialpartnersthefollowingstudieshavebeenperformedinthisthesis:1TheshortORFofLmo2whichisacquiredthroughPCRf

6、romtheconstructedvectorpGEXQasthetemplatehasbeeninsertedintotheeukaryoticexpressionvectorpcDNAMycHis6B.ThisnewconstructedvectoriscalledpcDNAMycHis6BLmo2S.2ThelongORFofLmo2whichisacquiredthroughPCRfromthecDNAofTALLcelllin

7、e8511asthetemplatehasbeeninsertedintotheprokaryoticexpressionvectorpET.ThisnewconstructedvectoriscalledpETLmo2L.3ExpectedinducedrecombinantproductwasobtainedfromtheconstructedprokaryoticexpressionvectorpETLmo2Landfurther