LMO2短剪接模式LMO2-c的功能初探及LMO2復(fù)合物抑制MiR-142轉(zhuǎn)錄的機制.pdf

1、第一部分:LMO2短剪接模式LMO2-c的功能初探原癌基因LMO2(也稱Ttg-2或Rbtn2)定位于人類11號染色體短臂1區(qū)3帶(11p13),最早是從帶有染色體易位t(11;14)(p13;q11)的急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)患者病變細胞的染色體斷裂點處克隆得到的。該基因隸屬于一類僅含兩個LIM結(jié)構(gòu)域而幾乎不含有其他成分的蛋白家族,因而由LIM only縮寫得名。LMO2基因?qū)t系細胞和T淋巴系細胞的分化都具有重要的作用：敲

2、除LMO2基因的小鼠在胚胎期卵黃囊血島不能正常發(fā)生,造成胚胎期約10.5天時死亡。LMO2基因的過表達可以導(dǎo)致急性T淋巴細胞白血病的發(fā)生,近期報道了2例X連鎖重癥合并免疫缺陷病(X-SCID)患兒在基因治療后發(fā)生了不可控的白血病樣T淋巴細胞增殖,進一步檢查證實這一現(xiàn)象是由治療載體插入LMO2基因上游導(dǎo)致LMO2基因的異常表達所致。先前的實驗中,我們利用5'RACE技術(shù)從成人腎組織mRNA中克隆到LMO2的另一種剪切模式(LMO2-c),

3、它編碼一個與原LMO2的N端序列不同的蛋白質(zhì),比LMO2少7個氨基酸,但保留了特征性的LIM結(jié)構(gòu)域。這個新蛋白的功能未知。 本研究旨在初步探討LMO2-c可能的生物學功能,主要進行了以下幾個方面的工作：(1)通過在真核細胞中表達LMO2-c與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的融合蛋白觀察其細胞定位,我們發(fā)現(xiàn)與LMO2不同,LMO2-c主要呈點狀聚集在細胞核的兩端。(2)比較了不同蛋白標簽(主要為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶標簽和麥芽糖結(jié)合蛋

4、白標簽)對LMO2融合蛋白沉淀技術(shù)的影響,發(fā)現(xiàn)MBP標簽在提高探針蛋白的可溶性的同時并未影響LMO2與已知蛋白間的相互作用。(3)通過基于MBP標簽的融合蛋白沉淀技術(shù)和哺乳動物雙雜交系統(tǒng)檢測LMO2-c與LMO2的轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子(GATA-1、LDB1)的相互作用,證實了LMO2-c能與K562細胞中內(nèi)源性的GATA-1、LDB1蛋白特異的結(jié)合。(4)通過哺乳動物雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)了LMO2-c和LMO2可以競爭性地結(jié)合LDB1。據(jù)此我們推測

5、LMO2-c可能通過競爭性結(jié)合GATA-1、LDB1等轉(zhuǎn)錄因子從而拮抗LMO2功能。 第二部分:LMO2復(fù)合物抑制microRNA-142轉(zhuǎn)錄的機制研究microRNA(miRNA)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源非編碼的單鏈小分子RNA,這種小分子RNA通過與靶mRNA的互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表達進行負調(diào)控,導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯抑制。越來越多的研究證據(jù)表明microRNA在正常的造血過程中發(fā)揮了重要作用,并與血液系統(tǒng)腫

6、瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但是對于血細胞生成過程中microRNA的表達和調(diào)控機制還知之甚少。只有miR-223最近被證實作為C/EBPα和NFI-A的靶分子在骨髓細胞分化過程中發(fā)揮重要作用,而同樣能促進T淋巴細胞分化的miR-142的表達調(diào)控機制尚未見報道。 本實驗室通過前期的生物信息學檢測發(fā)現(xiàn),在miR-142基因組序列上游1.9kb處存在一個典型的LMO2復(fù)合物(LMO2、LDB1、GATA1、TAL1、E47)結(jié)合序列,

7、而LMO2復(fù)合物又是特異調(diào)控造血發(fā)育的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,因此本部分實驗旨在探討LMO2復(fù)合物調(diào)控miR-142轉(zhuǎn)錄的分子機制。本文通過應(yīng)用啟動子活性分析、過表達、RNA干擾等分子生物學手段對miR-142基因的表達調(diào)控方式進行了研究,證實了LMO2參與形成的復(fù)合物能夠抑制miR-142啟動子的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)源性miR-142的表達。利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)進一步證實了細胞內(nèi)源性的LMO2能夠結(jié)合于miR-142啟動子序列的相應(yīng)LMO2復(fù)合

8、物結(jié)合位點。 本研究所發(fā)現(xiàn)的LMO2復(fù)合物抑制miR-142轉(zhuǎn)錄的機制有非常重要的意義：(1)目前已知的受LMO2復(fù)合物調(diào)控的基因有Runnx1、c-kit以及紅系特異性基因GPA和p4.2等,相比對前幾者的正調(diào)控作用,miR-142基因是第一個能夠被LMO2復(fù)合物負調(diào)控的下游靶基因,該發(fā)現(xiàn)顯示了LMO2復(fù)合物具有轉(zhuǎn)錄的雙向調(diào)節(jié)功能。(2)更為重要的是,鑒于miR-142基因是迄今為止唯一一個已知和T細胞發(fā)育相關(guān)的LMO2下游