Sp1對(duì)FHL2轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的和意義: FHL2（Four and ahalf LIM Protein2）為新確定的癌基因，在胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。關(guān)于FHL2下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控已有了一定的報(bào)道研究，但對(duì)其上游的相關(guān)調(diào)控尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬對(duì)人新癌基因FHL25’端上游進(jìn)行生物信息學(xué)分析以預(yù)測其5’端啟動(dòng)子位置和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。 材料和方法: 1、主要材料; Kato-Ⅲ、SW480和LoVo細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)

2、告基因檢測試劑盒，核蛋白提取試劑盒，poly（dl-dC），γ-32P，LipofectAMINE2000 Reagent，TRIzol，Sp1抗小鼠單克隆抗體，F(xiàn)HL2抗兔多克隆抗體，MithramycinA。 2、方法; 結(jié)果: 1、FHL2基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定擴(kuò)增了4段FHL2基因5’端上游啟動(dòng)子序列，大小分別為1008bp、881bp、595bp及382bp。上述片段分別插入到pGL

3、3-Basic載體構(gòu)建成重組質(zhì)粒，命名為pLuc-1008、pLuc-881、pLuc-595及pLuc-382。酶切鑒定與熒光素酶基因片段相符，證實(shí)載體構(gòu)建成功。DNA測序報(bào)告顯示與Genbank中序列完全吻合。 2、胃腸癌細(xì)胞株中FHL2重組啟動(dòng)子報(bào)告基因活性檢測; pGL3-Basic載體含有熒光素酶基因序列，并且載體本身不包含啟動(dòng)子，克隆入啟動(dòng)子后可用熒光素酶定量直觀地比較兩個(gè)啟動(dòng)子的活性及其在各種不同種類細(xì)胞

4、系中表達(dá)的組織特異性，并以pRL-CMV質(zhì)粒作為內(nèi)參以消除轉(zhuǎn)染效率的不同所帶來的差異。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同胃腸癌細(xì)胞后，熒光素酶活性RLU值（相對(duì)熒光單位）有不同的改變，表明所構(gòu)建的FHL2基因啟動(dòng)子報(bào)告系統(tǒng)有轉(zhuǎn)錄活性。4個(gè)不同的重組質(zhì)粒在胃癌Kato-Ⅲ細(xì)胞中活性分別為22.34±5.43，20.19±3.85，38.05±2.04和5.25±1.10；腸癌LoVo細(xì)胞中活性分別為4.30±0.85，4.65±0.68，9.46±2.31

5、和3.10±0.51；腸癌SW480細(xì)胞中活性分別為2.68±0.15，2.02±0.08，3.31±0.23和1.85±0.42。3株腫瘤細(xì)胞中均為pLuc-595的RLU值最高（方差分析/Welch整體檢驗(yàn)，F(xiàn)/Welch值分別為43.421，20.682和7.345，P值分別為0.000，0.000和0.038）。 3、免疫組織化學(xué)驗(yàn)證Sp1表達(dá)與FHL2表達(dá)成正相關(guān); 收集大腸及胃的癌旁粘膜和腫瘤組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行

6、免疫組織化學(xué)檢測。Sp1在40例癌旁腸粘膜組織中，表達(dá)為陰性的有22例，弱陽性的有8例，陽性的有8例，強(qiáng)陽性的有2例，平均秩為32.98；在44例腸癌組織中，表達(dá)為陰性的有12例，弱陽性的有3例，陽性的有16例，強(qiáng)陽性的有13例，平均秩為51.16，表達(dá)較癌旁組織增強(qiáng)具有顯著性（兩等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)，P=0.000）；在13例癌旁胃粘膜組織中，表達(dá)為陰性的有10例，弱陽性的有3例，無陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)，平均秩為10.04；在15例胃癌組織中

7、，表達(dá)為陰性的有4例，弱陽性的有5例，陽性的有4例，強(qiáng)陽性的有2例，平均秩為18.37，表達(dá)較癌旁組織增強(qiáng)具有顯著性（兩等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)，P=0.000）。FHL2在34例癌旁腸粘膜組織中，表達(dá)為陰性的有33例，弱陽性的有1例，無陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)，平均秩為21.72；在38例腸癌組織中，表達(dá)為陰性的有8例，弱陽性的有7例，陽性的有15例，強(qiáng)陽性的有8例，平均秩為49.72，表達(dá)較癌旁組織增強(qiáng)具有顯著性（兩等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)，P=0.000

8、）；在12例癌旁胃粘膜組織中，表達(dá)為陰性的有10例，無弱陽性表達(dá)，陽性的有1例，強(qiáng)陽性的有1例，平均秩為8.79；在16例胃癌組織中，表達(dá)為陰性的有1例，弱陽性的有4例，陽性的有7例，強(qiáng)陽性的有4例，平均秩為18.78，表達(dá)較癌旁組織增強(qiáng)具有顯著性（兩等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)，P=0.000）。對(duì)同時(shí)進(jìn)行了Sp1和FHL2的表達(dá)檢測的34例大腸癌病人使用相關(guān)分析Spearman檢驗(yàn)得到R=0.469，P=0.005，提示Sp1表達(dá)與FHL2表達(dá)

9、相關(guān)，且隨著Sp1表達(dá)量增高FHL2的表達(dá)量也增高。 4、Sp1能與FHL2啟動(dòng)子特異結(jié)合; 根據(jù)TFsearch軟件分析得出FHL2啟動(dòng)子上游中Sp1可能的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)了兩對(duì)探針分別為：探針1：（-485）5'agagggcccgggcttggaatgt3’（-464），探針2：（-123）5'tgccaccgcgcccaggcctcgt3'（-102）。以腸癌SW480細(xì)胞核提取物進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，電泳后曝光，標(biāo)記的

10、探針1+核蛋白抽提物泳道中出現(xiàn)一條特異的結(jié)合帶，使用50倍未標(biāo)記的探針1冷競爭反應(yīng)后條帶消失，而探針2泳道中未發(fā)現(xiàn)條帶。提示探針1能與目的核蛋白中的Sp1特異結(jié)合，而探針2不能與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合。使用標(biāo)記的突變探針1進(jìn)行競爭反應(yīng)該條帶消失，進(jìn)一步證實(shí)了Sp1能與FHL2啟動(dòng)子特異結(jié)合。 5、定點(diǎn)突變FHL2重組啟動(dòng)子后報(bào)告基因檢測活性下降; 根據(jù)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照定點(diǎn)突變?cè)噭┖性O(shè)計(jì)突變引物將探針-485agaggg

11、cccgggcttggaatgt-464中Sp1位點(diǎn)突變?yōu)閍gaggAccAggTcttggaatgt。突變后的質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定證實(shí)。將pLuc-595和pLuc-MT分別轉(zhuǎn)染入Kato-Ⅲ、SW480和LoVo細(xì)胞中比較熒光素酶活性變化。三株細(xì)胞中pLuc-MT的RLU值均較pLuc-595的RLU值降低具有顯著性（兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t值分別6.218、42.772和8.377，P值分別為0.003、0.000、0.001）。

12、6、siRNA及MIT抑制Sp1表達(dá)后FHL2重組啟動(dòng)子報(bào)告基因檢測活性下降; 在三株細(xì)胞中MIT實(shí)驗(yàn)組啟動(dòng)子活性較陰性對(duì)照組活性下降均有顯著性差異（P均<0.05）。SW480和LoVo細(xì)胞Sp1-siRNA實(shí)驗(yàn)組啟動(dòng)子活性較陰性對(duì)照組活性下降有顯著性差異（P均<0.05）：但Kato-Ⅲ細(xì)胞Sp1-siRNA實(shí)驗(yàn)組的RLU值較陰性對(duì)照組RLU值下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 7、siRNA及MIT抑制Sp1表達(dá)后

13、FHL2 mRNA及蛋白表達(dá)下降; Kato-Ⅲ、SW480和LoVo三株細(xì)胞中的Sp1-siRNA實(shí)驗(yàn)組和MIT實(shí)驗(yàn)組Sp1 mRNA水平均較陰性對(duì)照組中Sp1 mRNA水平顯著降低（P均<0.05），提示設(shè)計(jì)的Sp1-siRNA能有效抑制Sp1的mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組FHL2 mRNA水平較陰性對(duì)照組FHL2 mRNA水平也有顯著性降低（P均<0.05）。蛋白水平的檢測也有類似的結(jié)果（P均<0.05）。 結(jié)論:

14、 獲得了新癌基因FHL2的5'端啟動(dòng)子序列及轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息，根據(jù)Sp1結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)克隆的1008bp、881bp、595bp及382bp大小的FHL2啟動(dòng)子片段在胃腸癌細(xì)胞中有不同的轉(zhuǎn)錄活性，其中以pLuc-595活性最高。臨床標(biāo)本免疫組織化學(xué)檢測提示Sp1和FHL2在胃腸道腫瘤組織中均較癌旁正常組織高表達(dá)，且隨著Sp1表達(dá)量增高FHL2的表達(dá)量也增高，兩者在腫瘤組織中的表達(dá)量成正相關(guān)。通過EMSA進(jìn)一步證實(shí)了Sp1能與FHL25'端啟