HSF4蛋白的穩(wěn)定機制及其調(diào)控HMOX-1轉(zhuǎn)錄的研究.pdf

1、白內(nèi)障是人類致盲的首要因素。HSF4是白內(nèi)障的致病基因之一，在晶狀體中特異表達，調(diào)控一系列具有重要生理功能的基因表達。在小鼠晶狀體中，HSF4蛋白水平在不同的發(fā)育階段呈現(xiàn)出不同的變化，提示HSF4的表達水平受到精細調(diào)控，這種調(diào)控可能對于維持晶狀體的正常分化與發(fā)育非常重要。目前關(guān)于HSF4蛋白水平調(diào)控還缺乏研究。本論文發(fā)現(xiàn)BCAS2能夠與HSF4相互作用，并且在晶狀體上皮細胞中調(diào)控HSF4蛋白水平。首次發(fā)現(xiàn)HSF4蛋白調(diào)控的具體分子機制。

2、
　　首先采用酵母雙雜交的方法，以人的HSF4為誘餌蛋白，在構(gòu)建的人胎腦cDNA文庫中進行了篩選，對多個潛在的相互作用蛋白肽段進行分析，篩選到BCAS2蛋白。在晶狀體上皮細胞（HLECs）中通過免疫共沉淀（Co-IP）和細胞免疫熒光的方法進一步驗證了這兩個蛋白的相互作用。體內(nèi)免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，BCAS2在小鼠晶狀體上皮細胞中高表達，同時HSF4與BCAS2在小鼠晶狀體中也被證實存在相互作用。Co-IP實驗揭示了HSF4的HR-

3、A/B疏水結(jié)構(gòu)域和BCAS2的CC結(jié)構(gòu)域是這兩個蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　進一步探討B(tài)CAS2與HSF4相互作用對HSF4的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄活性的影響。我們觀察到在HLECs中表達BCAS2蛋白導(dǎo)致HSF4的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低；在BCAS2基因表達受到干擾的晶狀體上皮細胞系中，HSF4轉(zhuǎn)錄活性則顯著上調(diào)。同時發(fā)現(xiàn)HSF4的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控由蛋白變化引起。HSF4的蛋白水平隨著BCAS2的蛋白的上調(diào)而降低，但是HSF4的mRNA水平卻沒

4、有影響，提示在HLECs中BCAS2負調(diào)控HSF4的蛋白水平。當在細胞中表達CC結(jié)構(gòu)域缺失的BCAS2時，HSF4蛋白水平無顯著改變，提示這兩個蛋白的相互作用是BCAS2對HSF4調(diào)控的分子基礎(chǔ)。
　　為揭示BCAS2調(diào)控HSF4蛋白水平的具體機制，在BCAS2基因表達干擾的細胞系中通過檢測HSF4蛋白的半衰期，發(fā)現(xiàn)BCAS2表達降低可延長HSF4蛋白半衰期，確定BCAS2在蛋白水平上調(diào)控HSF4。同時檢測到HSF4的泛素化修飾作

5、用明顯下降，提示BCAS2可能通過泛素化途徑調(diào)控HSF4。利用MG132抑制細胞內(nèi)的蛋白酶體活性，通過檢測細胞中HSF4的蛋白表達情況后發(fā)現(xiàn)BCAS2對HSF4的調(diào)控作用被抑制，進一步證實BCAS2對HSF4的蛋白調(diào)控依賴于泛素化-蛋白酶體途徑。通過生物信息學(xué)預(yù)測和細胞實驗驗證，發(fā)現(xiàn)K206位點是HSF4一個重要的泛素化位點，該位點突變可抑制BCAS2對HSF4的調(diào)控作用，說明BCAS2通過調(diào)控206位賴氨酸的泛素化修飾調(diào)控HSF4的蛋

6、白水平。
　　此外，我們還發(fā)現(xiàn)HSF4能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控一個新的抗氧化基因HMOX-1的表達。在晶狀體上皮細胞中過表達HSF4，發(fā)現(xiàn)HMOX-1的蛋白以及mRNA表達明顯上升。而在HLECs中利用siRNA的方法干擾HSF4，發(fā)現(xiàn)HMOX-1蛋白以及mRNA表達均顯著下降。通過免疫染色質(zhì)共沉淀實驗和熒光素酶方法，發(fā)現(xiàn)HSF4蛋白可直接結(jié)合到HMOX-1啟動子上，并且啟動基因的轉(zhuǎn)錄表達。采用生物信息學(xué)的方法，我們發(fā)現(xiàn)HMOX-1啟動子區(qū)域

7、包含一段熱休克結(jié)合元件。該元件中保守位點突變后，能夠抑制HSF4對該啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。這些結(jié)果表明HSF4能夠直接結(jié)合到HMOX-1啟動子的-389–-362區(qū)域的熱休克元件（HSE）上，激活HMOX-1的轉(zhuǎn)錄表達，提示HSF4在晶狀體中可能通過調(diào)控HMOX-1表達實現(xiàn)抗氧化功能。
　　綜上所述，本論文發(fā)現(xiàn)BCAS2為一個重要調(diào)節(jié)因子維持細胞內(nèi)HSF4的蛋白穩(wěn)態(tài)。BCAS2通過促進HSF4泛素化修飾維持其在晶狀體細胞中的表達水