毛白楊MYB055轉(zhuǎn)錄因子在次生壁合成中的調(diào)控機制研究.pdf

1、楊樹是我國的主要栽培樹種之一，天然林和人工林的總面積達到1200多萬公頃，除了用于防風(fēng)固沙、保持水土和綠化景觀之外，楊樹還廣泛地應(yīng)用于造紙、建筑用材、家具等領(lǐng)域。因此，楊樹具有非常重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值。但由于楊樹生長周期長，傳統(tǒng)的育種方法目的性差，耗時長，可操作性低，這嚴重限制了楊樹的新品種培育。隨著基因工程的飛速發(fā)展，利用生物技術(shù)手段高效快速地育種已成為可能。
　　楊樹作為重要的造紙原材料來源，在工業(yè)紙漿生產(chǎn)過程中，由于木質(zhì)

2、素與纖維素難以分離，因此造成了巨大的工業(yè)污染以及原材料浪費。若能搞清木質(zhì)素生物合成的調(diào)控機制，就可調(diào)控木材中木質(zhì)素的組分及含量，生產(chǎn)出人們期望的木材。為此，本論文從毛白楊中克隆了一個MYB轉(zhuǎn)錄因子，同源比對分析顯示，PtoMYB055的氨基酸序列與R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列具有較高的同源性，進化分析結(jié)果表明，PtoMYB055與其他物種中參與調(diào)控木質(zhì)素合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子具有較近的親緣關(guān)系。這些證據(jù)暗示，PtoMYB055轉(zhuǎn)錄

3、因子可能參與了楊樹木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。
　　半定量和熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，PtoMYB055在莖、葉柄、韌皮部及木質(zhì)部中大量表達。啟動子分析進一步證實，該基因在在莖、葉柄、韌皮部表達，其中在木質(zhì)部中含量最高，該結(jié)果與組織中的表達情況一致。
　　亞細胞定位的結(jié)果顯示，作為轉(zhuǎn)錄因子，PtoMYB055蛋白定位在細胞核內(nèi)。酵母單雜交的實驗，證明它具有轉(zhuǎn)錄激活作用，為激活型的轉(zhuǎn)錄因子。
　　利用葉盤法的遺傳轉(zhuǎn)化方式獲得

4、若干陽性轉(zhuǎn)基因植株，與同樣生長條件下的野生型毛白楊對比，PtoMYB055過表達植株呈現(xiàn)出植株矮化、葉片蜷曲的表型。這一現(xiàn)象與其同源基因AtMYB61在擬南芥中過量表達植株的表型一致。
　　統(tǒng)計分析顯示，過表達植株葉片面積顯著變小，植株高度顯著降低。組織切片染色結(jié)果表明，過表達植株木質(zhì)素發(fā)生異位沉積。木質(zhì)素自發(fā)熒光結(jié)果也表明過表達植株木質(zhì)素發(fā)生異位沉積。Klason法測定木質(zhì)素含量發(fā)現(xiàn)，超量表達PtoMYB055導(dǎo)致植株中木質(zhì)素含

5、量顯著增加。
　　對PtoMYB055過表達植株的葉片觀察顯示，早期幼嫩葉片葉脈處呈現(xiàn)明顯木質(zhì)素異位沉積現(xiàn)象，成熟葉片則與野生型無明顯差異，葉脈橫向切片及間苯三酚染色結(jié)果顯示，過表達植株出現(xiàn)木質(zhì)素異位沉積。
　　通過熒光定量PCR對PtoMYB055超量表達的轉(zhuǎn)基因楊樹中基因的檢測，發(fā)現(xiàn)C4H4、 CAD1、 CCOAOMT1、 CCR2、 F5H2、 COMT2、 C3H3、 PAL4、4CL5、 GT43B、GT43D、