丹參毛狀根中酚酸類和酮類成分合成途徑中bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控.pdf

1、丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，由于其對(duì)心腦血管疾病的預(yù)防和治療效果顯著而被廣泛關(guān)注。丹參中含丹酚酸和丹參酮，為其藥效成分，由于需求量的增大，丹參藥材品質(zhì)也越來(lái)越受到重視，對(duì)于如何增加丹參巾有效成分含量，進(jìn)而提高丹參藥材品質(zhì)已然成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。本研究以丹參毛狀根為材料，對(duì)丹參酚酸類及丹參酮類成分的代謝調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　1.利用終濃度為15μmol·L-1銀離子（Ag+）和100

2、μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)兩種誘導(dǎo)子分別對(duì)培養(yǎng)18天的丹參毛狀根進(jìn)行誘導(dǎo)處理，分別在處理后第1、2、3、6、9天采集樣品;利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)毛狀根中丹酚酸類和丹參酮類成分含量進(jìn)行檢測(cè)，并采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)對(duì)丹參酚酸類和丹參酮類成分代謝途徑上關(guān)鍵酶基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示兩種誘導(dǎo)子處理后，丹參酮和丹酚酸兩類成分含量都發(fā)生了變化，相應(yīng)基因表達(dá)也都得到了提高。Ag+顯著增加了迷迭香酸(RA)、阿魏酸

3、和咖啡酸的含量，但對(duì)丹參素(DSU)和丹酚酸B(LAB)的生物合成卻起到了抑制作用，總酚酸含量變化不大;而四種丹參酮成分含量全部得到提高，總的丹參酮含量也顯著增加。說(shuō)明相對(duì)于酚酸類成分，丹參酮類成分對(duì)于Ag+的誘導(dǎo)更加敏感。經(jīng)MeJA處理后，丹參毛狀根中各種丹酚酸類成分含量顯著增加，特別是RA和LAB，總酚酸含量也明顯提高;對(duì)丹參酮Ⅰ(TⅠ)的代謝積累影響不大，并且抑制了丹參酮ⅡA(TⅡA)的生物合成，但是顯著促進(jìn)了隱丹參酮(CT)和二

4、氫丹參酮Ⅰ(DTⅠ)代謝積累，總的來(lái)說(shuō)對(duì)丹參酮類含量影響效果不明顯。Ag+和MeJA處理后丹酚酸類和丹參酮類代謝關(guān)鍵基因表達(dá)都受到了影響，說(shuō)明Ag+和MeJA是通過(guò)影響了整個(gè)代謝途徑上的相關(guān)基因進(jìn)而對(duì)次生代謝產(chǎn)物合成產(chǎn)生影響。對(duì)于丹參酮類代謝途徑來(lái)說(shuō)，MEP途徑對(duì)于兩種誘導(dǎo)子的響應(yīng)明顯強(qiáng)于MVA途徑。
　　2.利用同源克隆法及文庫(kù)篩選法從丹參中獲得了bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子的基因序列各4個(gè)，分別命名為 SmbHLH7、SmbHL

5、H8、SmbHLH9、SmbHLH10、SmWD40-2、SmWD40-5、SmWD40-6和SmWD40-8。對(duì)其序列分析可知分別包含了一個(gè)2392bp、675bp、912bp、972bp、1740bp、1026bp、3396bp和1338bp的開放閱讀框，分別編碼636、224、303、323、579、341、114和445個(gè)氨基酸。在bHLH的4條氨基酸序列都分別包含1個(gè)HLH結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明它們均為bHLH蛋白;而4條WD40的氨基

6、酸序列中全部含有幾個(gè)數(shù)目不等的WD-repeat結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明它們屬于WD40轉(zhuǎn)錄因子家族。
　　3.利用克隆得到的4條丹參bHLH和4條WD40轉(zhuǎn)錄因子基因，以及表達(dá)載體pCAMBIA-1300(B34)，構(gòu)建過(guò)表達(dá)重組載體，然后通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化體系獲得轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根。成功構(gòu)建出丹參bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子基因過(guò)表達(dá)類型毛狀根各4種，并對(duì)所獲得毛狀根進(jìn)行了分子鑒定，證明重組過(guò)表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化。這為