丹參酚酸類成分生源途徑的探索及相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)以迷迭香酸(RA)和丹酚酸B(SAB)為代表的水溶性酚酸類成分被認(rèn)為是丹參發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)基礎(chǔ)的重要部分，逐漸受到研究人員的關(guān)注。但目前對(duì)于丹參水溶性酚酸類生源途徑的研究還剛剛起步，尤其是丹參中標(biāo)志性酚酸類成分丹酚酸B的代謝途徑還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。同時(shí)對(duì)于丹參中已有報(bào)道的另一標(biāo)志性成分迷迭香酸的生源途徑研究還不夠全面，其下游

2、的關(guān)鍵酶基因SmRAS，SmCYP98A14并未有相關(guān)研究。因此針對(duì)這些問(wèn)題的研究對(duì)于丹參中酚酸類資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。
　　 本研究利用13C同位素標(biāo)記前體飼喂的方法，對(duì)丹參酚酸類化合物尤其是丹酚酸B的生源途徑進(jìn)行了探索，并利用動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的方法對(duì)已報(bào)道的迷迭香酸的生源途徑進(jìn)行了重新評(píng)價(jià)。同時(shí)，克隆得到了酚酸類生源途徑上的3個(gè)重要基因SmRAS、SmCYP98A14，SmCPR，并對(duì)這3個(gè)基因的功能進(jìn)行了研究。我們得到了如下

3、結(jié)果：
　　 1、首次通過(guò)同位素標(biāo)記提出了迷迭香酸到丹參酚酸B可能的生物合成過(guò)程，兩分子迷迭香酸經(jīng)過(guò)催化生成丹酚酸E，丹酚酸E環(huán)合生成丹酚酸B。這是首次對(duì)丹參酚酸B的生源途徑進(jìn)行探索，為解決丹參酚酸類化合物生物合成的這一重要問(wèn)題提供了有價(jià)值的信息。
　　 2、利用同位素標(biāo)記動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的方法對(duì)迷迭香酸生源途徑進(jìn)行了重新評(píng)估。結(jié)果顯示，丹參中迷迭香酸生物合成的主要以咖啡酰CoA和4-羥基苯乳酸生成咖啡酰-4-羥基本乳酸，而后在

4、SmCYP98A14的催化下生成迷迭香酸為主，而非之前報(bào)道的4-香豆酰CoA與4-羥基苯乳酸反應(yīng)生成4-香豆酰-3-4-羥基苯乳酸，而后在SmCYP98A14的催化下生成迷迭香酸。這個(gè)結(jié)論改變了我們之前對(duì)迷迭香酸生物合成過(guò)程的認(rèn)識(shí)，對(duì)重新認(rèn)識(shí)迷迭香酸生物合成有重要價(jià)值。
　　 3、在以上研究基礎(chǔ)上，首次將迷迭香酸與丹酚酸B的生物合成的過(guò)程聯(lián)系到一起，描述了從苯丙氨酸和酪氨酸開(kāi)始經(jīng)迷迭香酸最終生成丹酚酸B的整個(gè)過(guò)程，極大拓展了丹參

5、酚酸類化合物的生源途徑，幫助人們重新認(rèn)識(shí)酚酸類化合物的生物合成過(guò)程。
　　 4、克隆得到了丹參酚酸類生源途徑上的關(guān)鍵酶基因SmRAS(GenbankaccessionNo.ADA60182)包含1489bp堿基，其中包括1284bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼428個(gè)氨基酸、SmCYP98A14(GenbankaccessionNo.HQ316179)包含1714bp堿基，其中包括1527bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼508個(gè)氨基

6、酸、SmCPR(GenbankaccessionNo.FR693803)，包含2771bp堿基，其中包括2118bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼705個(gè)氨基酸。
　　 5、考察了這三個(gè)基因在不同組織器官中的表達(dá)水平及誘導(dǎo)表的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因在根莖葉中均有表達(dá)，SmRAS在莖中表達(dá)最高、SmCYP98A14在根中表達(dá)最高、SmCPR在葉中表達(dá)最高。誘導(dǎo)表達(dá)研究表明，這三個(gè)基因均能被甲基茉莉酸(MeJA)及脫落酸(ABA)誘導(dǎo)

7、表達(dá)上調(diào)。
　　 6、通過(guò)RNAi干擾研究驗(yàn)證了SmRAS及SmCYP98A14基因在酚酸類生物合成過(guò)程中的功能。RNAi干擾SmRAS及SmCYP98A14能夠明顯降低丹參毛狀中迷迭香酸和丹酚酸B的含量。RNAi-SmRAS效果最顯著株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量均低于CK的20％，RNAi-SmCYP98A14效果最顯著株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量為于CK的30％。對(duì)這兩個(gè)基因的RNAi均導(dǎo)致酚酸類合成途徑上其它基因表達(dá)明