茉莉酸信號途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2調(diào)控丹參有效成分生物合成的功能解析.pdf

1、丹參Salvia miltiorrhiza Bunge為唇形科鼠尾草屬植物，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥用部位為根及根莖，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效，臨床用于治療冠心病、心絞痛、缺血性腦卒中等疾病，其有效成分主要包括以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性萜類化合物和以丹參酚酸B為主的水溶性酚酸類化合物。文獻報道，MeJA誘導處理可以使丹參酮ⅡA的含量提高4.5倍，丹參酚酸B的含量提高6倍。然而，MeJA促進丹參酮ⅡA和丹參酚酸B生物合成的機制未得到闡明

2、。
　　我們通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的方法篩選出了受MeJA誘導上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2a和SmMYC2b。SmMYC2a的開放閱讀框（ORF）長1803個堿基，該ORF編碼了一個含有600個氨基酸的蛋白質(zhì);SmMYC2b的ORF含1824個堿基，該ORF編碼了一個含有607個氨基酸的蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，SmMYC2a和SmMYC2b都含有bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH家族。此外，這兩個轉(zhuǎn)錄因子還含有保守的JID結(jié)構(gòu)域，可能與J

3、AZ蛋白存在互作。
　　MeJA誘導實驗表明，SmMYC2都早期響應(yīng)MeJA，在0.5 h的時候表達量最高。不同的是，MYC2a在0.5 h以后呈緩慢下降趨勢，而MYC2b則在1h就迅速下降到了基值，表明比起SmMYC2b，SmMYC2a可能具有更加廣泛的調(diào)節(jié)作用。
　　亞細胞定位實驗結(jié)果表明，SmMYC2都定位在細胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子定位在細胞核的基本特性。
　　為驗證SmMYC2在體內(nèi)的功能，考察其是否能夠影響丹參酮

4、和丹參酚酸B的合成。構(gòu)建了MYC2-NAi的載體，C58C1農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化丹參發(fā)根。QRT-PCR的結(jié)果顯示，RNAi沉默SmMYC2 a/b后，丹參酮類合成途徑和丹參酚酸合成途徑的基因的表達與對照比均有顯著降低。除了共同調(diào)控基因CMK，CPS，TPS，PAL，RAS6和CYP98A14，SmMYC2a還影響了HMGR，MCS，GPPS，GGPPS和KSL的表達，SmMYC2b還影響了MK和DXR的表達。
　　含量測定結(jié)果表明

5、，在MYC2a-RNAi和MYC2b-RNAi的轉(zhuǎn)基因發(fā)根中，萜類化合物丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮含量均有不同程度的降低，酚酸類化合物苯丙氨酸、尿黑酸、迭香酸、丹參酚酸A、丹參酚酸B的含量也有顯著降低。MYC2a的沉默使得丹參酮ⅡA的含量下降至對照的6.4％，丹參酚酸B下降至對照的23.2％;MYC2b的沉默使得丹參酮ⅡA的含量下降至對照的40.2％，丹參酚酸B下降至對照的5.0％。說明MYC2a和MYC2b都是正調(diào)控的

6、轉(zhuǎn)錄因子，都對多個酶基因、多條合成途徑、多種化合物起到了調(diào)控作用，其調(diào)控結(jié)果是相似的。然而，其影響的關(guān)鍵基因是不完全相同的，表明這兩個轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控丹參有效成分生物合成的機制上存在差異，是不可替代的。
　　為了進一步研究MYC2調(diào)控丹參酮和丹參酚酸生物合成的分子機制，擴增了多個關(guān)鍵酶基因的啟動子，篩選出包含MYC2結(jié)合位點E-box的基因，設(shè)計了相應(yīng)的探針，進行了電泳遷移率實驗(EMSA)實驗。結(jié)果表明，SmMYC2a能夠與酚酸類

7、合成途徑中的關(guān)鍵基因SmRAS6，SmCYP98A14結(jié)合，SmMYC2b能夠與SmCYP98A14結(jié)合，證明SmMYC2a可能通過調(diào)控SmRAS6，SmCYP98A14來影響酚酸類化合物的合成，SmMYC2b可能通過調(diào)控SmCYP98A14影響酚酸類化合物的合成。
　　為研究MYC2的激活機制，進行了酵母雙雜交（Yeast two hybrid，Y2H）實驗。結(jié)果表明，SmMYC2a/b和SmJAZ1，SmJAZ2均有很強的互作

8、，證明這兩個MYC2是SmJAZ1和SmJAZ2的靶標蛋白，且MYC2-JAZ的結(jié)合抑制了MYC2對關(guān)鍵酶基因(SmRAS6和SmCYP98A14)的轉(zhuǎn)錄激活。
　　綜上所述，本研究通過對JA信號關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2調(diào)控丹參酮和丹參酚酸合成的功能研究，建立了JA-MYC2-關(guān)鍵酶基因-有效成分的網(wǎng)絡(luò)，拓展了人們對丹參有效成分生物合成調(diào)控的認識，從而為闡明丹參有效成分的合成和調(diào)控途徑，進而為開展生物合成途徑的遺傳改造、培育優(yōu)良品