基于聯(lián)合測序技術(shù)的丹參活性成分生物合成及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、課題組在國際上首次提出構(gòu)建藥用模式植物研究體系，該體系的建立對推動中藥現(xiàn)代化研究具有重要意義。丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，具有基因組小、染色體數(shù)目少、世代周期短、組織培養(yǎng)和毛狀根轉(zhuǎn)化技術(shù)成熟等特點(diǎn)，在中藥活性成分生物合成及調(diào)控機(jī)制研究中發(fā)揮作用，被認(rèn)為是理想的藥用模式植物。丹參基因組和轉(zhuǎn)錄組的測定為活性成分生物合成途徑的解析及調(diào)控機(jī)制研究提供基因數(shù)據(jù)庫，其功能基因組學(xué)亟需開展

2、創(chuàng)新性研究。
　　本論文聯(lián)合三代測序技術(shù)及二代測序技術(shù)，綜合利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生物信息學(xué)以及化學(xué)等多學(xué)科理論與方法，開展丹參根全長轉(zhuǎn)錄組研究，鑒定丹參轉(zhuǎn)錄本可變剪接現(xiàn)象，探討基因表達(dá)與丹參活性成分合成的一致性，并對合成途徑中未知酶的編碼基因進(jìn)行預(yù)測。主要研究結(jié)果如下:
　　1.丹參全長轉(zhuǎn)錄組測序。首次結(jié)合三代測序(SMRT)及二代測序(Illumina HiSeq)技術(shù)在植物領(lǐng)域解析全長轉(zhuǎn)錄本;從組學(xué)水平分析藥用模式植

3、物丹參的基因可變剪接現(xiàn)象?；诼?lián)合測序技術(shù)的全長轉(zhuǎn)錄組測序共獲得636，805條高質(zhì)量雜合轉(zhuǎn)錄本，其N50為2411 bp，而僅用二代測序組裝后的轉(zhuǎn)錄本N50為1530 bp;聯(lián)合測序顯著提高全長轉(zhuǎn)錄本的鑒定效率，以萜類合酶的編碼基因為例，二代測序技術(shù)僅組裝到42％的全長轉(zhuǎn)錄本，而聯(lián)合測序鑒定到71％的全長轉(zhuǎn)錄本;融合二代測序reads、雜合轉(zhuǎn)錄本、可變剪接位點(diǎn)信息以及丹參基因組信息，檢測到4035個基因異構(gòu)體，并且預(yù)測到16，241基

4、因異構(gòu)體;40％的丹參多外顯子基因座位存在可變剪接現(xiàn)象，可變剪接類型復(fù)雜多樣。
　　2.丹參酮生物合成相關(guān)基因的鑒定及預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)二萜合成相關(guān)的SmDXS2、SmDXR、 SmHDS、 SmHDR1、 SmHDR3、 SmlPI1、 SmGGPPS1、 SmCPS1、 SmCPS5、SmKSL1和SmKSL7基因在周皮的表達(dá)最高(log2 ratio≥1，F(xiàn)PKM＞10)，與丹參酮IIA在根不同組織的分布一致，其在周皮的含量分別

5、是韌皮部和木質(zhì)部的17倍和185倍。因此，丹參根的周皮不僅僅是丹參酮的積累部位，也是丹參酮主要的合成部位。基于丹參基因組，系統(tǒng)分析了可能參與萜類代謝的重要氧化酶/脫氫酶，基因組分別注釋到457個CYP450s、144個2ODDs和159個SDRs基因;根據(jù)丹參酮的合成和積累規(guī)律，篩選并預(yù)測參與丹參酮合成的15個CYP450s、1個2ODD和5個SDRs基因;對候選基因進(jìn)行克隆分析，構(gòu)建RNAi和過表達(dá)載體，并建立丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根體系，在

6、丹參毛狀根中初步預(yù)測候選基因的具體功能。此外，基于丹參全長轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，本研究鑒定到丹參酮合成途徑的相關(guān)基因及候選基因的全長轉(zhuǎn)錄本20個，其中6個存在可變剪接現(xiàn)象。
　　3.丹酚酸生物合成相關(guān)基因的鑒定及預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸合成相關(guān)的SmPAL1、 SmPAL3、SmC4H1、 Sm4CL3、Sm4CL-like i、Sm4CL-like4、SmTAT1、SmHPPR3、SmRAS和SmCYP98A78在丹參的韌皮部和木質(zhì)部中

7、的表達(dá)量高于周皮，與丹酚酸B在根不同組織的分布一致，其在韌皮部和木質(zhì)部中的含量是周皮的5倍。因此，丹酚酸在丹參根中主要在韌皮部和木質(zhì)部中合成和積累?；诖艘?guī)律以及MeJA對丹酚酸合成的顯著誘導(dǎo)，對丹參迷迭香酸合成途徑中未知CYP450進(jìn)行篩選，預(yù)測到2個CYP450s可能在丹參迷迭香酸合成途徑中催化4-羥基苯乳酸合成3，4-二羥基苯乳酸?；诘⒒蚪M，對可能參與迷迭香酸聚合為丹酚酸的多銅氧化酶家族進(jìn)行系統(tǒng)分析，基因組注釋到80個編碼多

8、銅氧化酶的基因，其中漆酶32個;根據(jù)丹酚酸的合成和積累規(guī)律，篩選并預(yù)測參與丹酚酸合成的多銅氧化酶編碼基岡5個。此外，基于丹參全長轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，本研究鑒定到丹酚酸合成途徑的相關(guān)基因及候選基因的全長轉(zhuǎn)錄本26個，其中11個存在可變剪接信息。
　　4.丹參活性成分合成調(diào)控相關(guān)poly(A) lncRNA的鑒定及預(yù)測?；诘⒏煌M織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定到13，928條丹參lncRNA;基于活性成分在丹參根組織的差異積累及相關(guān)合成基因的