日本對蝦免疫相關(guān)基因的克隆及功能的初步研究.pdf

1、對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是危害養(yǎng)殖對蝦的主要病原,也是制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最重要因素。要尋找抵御該病原的有效方法,最基本的入手點之一就是充分了解作為病原宿主的對蝦的免疫機制,通過提高其自身的抗病毒能力,來達到從根本上防治WSSV的目的。因此本論文以具有重要經(jīng)濟價值的日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)為對象,首先構(gòu)建了用于探尋蛋白質(zhì)相互作用及調(diào)控機制網(wǎng)絡(luò)的酵母雙雜交文庫,這一平臺為后續(xù)研究蛋白質(zhì)在日本對蝦抗病毒

2、免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。而后,本論文又對幾個與日本對蝦天然免疫密切相關(guān)的基因展開初步的研究,為建立有效的對蝦病害防治方法提供科學(xué)依據(jù)和思路。
　　 本論文以日本對蝦血細胞和肝胰腺組織混合mRNA為模版,利用SMART技術(shù)和酵母體內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建酵母雙雜交文庫,并以日本對蝦翻譯調(diào)控腫瘤蛋白TCTP為誘餌蛋白對文庫進行初步篩選。文庫dsDNA條帶最大可達5kb。文庫轉(zhuǎn)化效率為4.8×105轉(zhuǎn)化子/ug pGADT7-Rec,文庫

3、容量為1.4×106克隆子/ml,重組率大于90％。初篩結(jié)果驗證了我們所構(gòu)建的日本對蝦酵母雙雜交文庫有效、可靠。
　　 本論文通過巢式PCR及RACE等方法獲得了日本對蝦的兩種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因——ERK1/2和p38。根據(jù)人們在其它物種中的研究報道,這是兩種在各項細胞活動包括抗病毒免疫中具有極為重要地位的基因。通過對兩種基因的序列分析發(fā)現(xiàn),日本對蝦的ERK1/2和p38具備與其他物種中的這兩種基因同樣的基本特征

4、和功能結(jié)構(gòu)域。而且通過Western blot檢測后發(fā)現(xiàn),日本對蝦的ERK1/2蛋白在WSSV病毒感染后磷酸化水平即活性上調(diào),且該現(xiàn)象發(fā)生在病毒感染早期,說明在日本對蝦中,ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以被WSSV所激活,且可能是被病毒進入宿主細胞這一過程所誘導(dǎo)。然而,在本研究中,我們還發(fā)現(xiàn)日本對蝦的ERK1/2和p38蛋白與其他物種之間的不同之處。首先,日本對蝦的ERK1/2蛋白在Western blot檢測時只顯示出一種分子量大小的條帶

5、,說明日本對蝦的ERK1/2蛋白可能不具有如高等動物中的分化。此外,我們克隆到的日本對蝦p38基因編碼的蛋白質(zhì)同其他物種進行比較在C端缺少了近100個氨基酸,但是該現(xiàn)象是否真實,它發(fā)生的具體因為還需要進一步的實驗確認。
　　 本論文中還報道了日本對蝦中一個與WSSV感染相關(guān)的基因——centaurin—α1。由于在早期實驗中,我們已經(jīng)獲得了該基因的部分序列,因此,我們首先通過Real time PCR檢測了該基因與WSSV感染的

6、關(guān)系。結(jié)果顯示,該基因轉(zhuǎn)錄水平的表達量隨著病毒感染時間延長,病毒量增加可以顯著升高,而且這種現(xiàn)象是在病毒感染早期到中期時出現(xiàn)的,說明該基因可以被WSSV感染所誘導(dǎo),且在病毒感染過程的早中期參與細胞活動。然而,有趣的是,該基因的轉(zhuǎn)錄水平表達量在抗病蝦中相比于普通蝦卻是明顯下調(diào)的,在后者中,centaurin—α1基因的轉(zhuǎn)錄量約為前者的3.6倍。這樣的結(jié)果說明,centaurin—α1基因及其編碼的蛋白質(zhì)在日本對蝦的天然免疫中的作用可能是雙