日本七鰓鰻Tec的基因編碼區(qū)克隆、重組表達及相關(guān)免疫學(xué)研究.pdf

1、分類號：密級：學(xué)校代碼：10165學(xué)號：20121100t101遣掌師筢大學(xué)碩士學(xué)位論文日本七鰓鰻Tec的基因編碼區(qū)克隆、重組表達及相關(guān)免疫學(xué)研究作者姓名：學(xué)科、專業(yè)：研究方向：導(dǎo)師姓名：李冉冉細胞生物學(xué)免疫細胞分化調(diào)控劉欣教授2015年4月遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要Tec酪氨酸蛋白激酶是一種非受體酪氨酸蛋白激酶，它是一種細胞質(zhì)蛋白，主要表達在免疫相關(guān)組織和肝細胞中，Tec參與G蛋白偶聯(lián)受體和白介素介導(dǎo)的信號通路，調(diào)節(jié)諸多生物進程，而

2、且還是T細胞受體信號重要的調(diào)節(jié)分子。本文實驗中，在七鰓鰻血液cDNA庫中成功克隆TecORF區(qū)序列。七鰓鰻Tec(LjaTec)序列包含1923bpORF區(qū)，69bp5’UTR區(qū)以及1037bp3’UTR區(qū)。對其序列進行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，Tec氨基酸序列包含了PH結(jié)構(gòu)域、Btk結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域和TKD激酶結(jié)構(gòu)域。而且，對Tee序列進行生物信息學(xué)分析，并選取24個物種從哺乳動物到無頜類動物建進化樹，以及MEME軟件分析其進

3、化歷程。發(fā)現(xiàn)七鰓鰻Tec位于脊椎動物進化的最低處，符合進化規(guī)律。利用RT—PCR法檢測Tec基因水平上在七鰓鰻髓樣小體、鰓、白細胞、腎和心免疫相關(guān)組織中的分布情況，發(fā)現(xiàn)刺激后鰓和白細胞中Tec的轉(zhuǎn)錄情況明顯上調(diào)。同時，用westernblot分析了Tec轉(zhuǎn)錄水平上七鰓鰻刺激前后在以上組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)刺激后白細胞的表達明顯上調(diào)。表明了Tec可能參與免疫應(yīng)答，在七鰓鰻適應(yīng)性免疫中起到重要作用。構(gòu)建了Pet32a()Tec表達載體，轉(zhuǎn)入

4、表達感受態(tài)EcoliBL2l中進行表達，然后用0Immoi／LIPTG、300C誘導(dǎo)蛋白表達，得到了重組蛋白Tec，超聲破碎后，Tec蛋白主要在沉淀中表達，為不可溶蛋白。用包涵體純化方法，經(jīng)組氨酸親和層析純化后，得到純化的重組蛋白Tec。利用Tec抗體經(jīng)westernblot鑒定Tec重組蛋白和天然蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tec蛋白在七鰓鰻白細胞中混合菌刺激前后變化比較明顯。接著研究了免疫沉淀，檢測與Tec相互作用蛋白，結(jié)果還需進一步驗證。免疫熒