重組日本七鰓鰻GRIM19基因的克隆及其對腫瘤細胞凋亡的誘導.pdf

1、GRIM-19是一種“細胞凋亡調節(jié)因子”，在大多數(shù)真核生物中普遍存在，它能引起多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，反義敲除GRIM-19可有效抑制干擾素(IFN)和反式視黃酸(RA)所誘導的細胞凋亡從而刺激細胞過度增殖。同時GRIM-19還與胚胎早期發(fā)育、前列腺癌、局限性回腸炎、卡波式肉瘤等疾病的發(fā)生密切相關。線粒體與細胞凋亡有著密切的關系包括：釋放凋亡蛋白酶激活因子如Cyto-c；呼吸鏈中斷：線粒體跨膜電位的消失以及與Bcl-2蛋白家族的促凋亡和抗

2、凋亡功能相關等方面，而GRIM-19的N末端含有線粒體定位序列，它的缺失可導致細胞形態(tài)以及線粒體結構的改變，GRIM-19在復合體I的裝配和整個線粒體電子傳遞能力上起著至關重要的作用。GRIM-19還可以通過與其它細胞因子相互作用來調控細胞的增殖、凋亡過程。目前已發(fā)現(xiàn)與GRIM-19相互作用的細胞因子主要有STAT3、GW112、vIRF1、NOD2等，其中STAT3即信號轉導與轉錄激活因子3是一種癌基因，在接受來自胞外的刺激因素作用后

3、能調控Cyclin D1、Bcl-2等靶基因的轉錄，進而影響細胞的增殖和凋亡，GRIM-19可與STAT3的反式激活結構域TAD尤其是第727位上的絲氨酸殘基進行特異性結合從而抑制STAT3的核轉位及其相關靶基因的表達。由此可見GRIM-19能特異性抑制STAT3發(fā)揮作用來阻斷腫瘤細胞的信號傳遞途徑促使腫瘤細胞凋亡，而重組日本七鰓鰻GRIM19基因發(fā)現(xiàn)于日本七鰓鰻(Lampetra japonica)口腔腺EST文庫，其與GRIM-19

4、具有相同的功能結構域及較高的序列同源性，這使得rLiGRIM19有望成為高效低毒的抗腫瘤基因新藥。
　　 鑒于此本文在實驗室先期構建的日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一條能翻譯出GRIM-19結構域的開放閱讀框(ORF)將其基因命名為rLjGRIM19，從日本七鰓鰻口腔腺中提取總RNA，根據(jù)此開放閱讀框的cDNA序列自行設計引物進行RT-PCR擴增獲得了435bp的rLjGRIM19基因。測序結果及分析顯示rLiGRIM19

5、基因表達蛋白含有144個氨基酸殘基，并含有相同的GRIM-19的功能結構域。通過與GenBank中的13個物種包括黑猩猩、人、大猩猩、猩猩、家犬、家牛、小家鼠、黑青斑河豚、大菱鲆、大西洋鮭、非洲爪蟾、斑馬魚、文昌魚進行了氨基酸序列的比對，結果發(fā)現(xiàn)rLiGRIM19同這些物種都具有相同的GRIM-19的功能結構域和較高的同源性，又將rLiGRIM19進行克隆、轉化與誘導表達和親和純化后得到其重組的融合蛋白，分子量為20kD。為了研究rLi

6、GRIM19基因是否具有典型的GRIM-19基因誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的功能將該基因連接到帶有綠色熒光蛋白報告基因的真核表達載體pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO中，利用脂質體轉染法將重組質粒轉染至人宮頸癌Hela細胞和肝癌細胞HepG2中，利用蘇木素伊紅(HE)染色法、Hoechst熒光染色法和DNA Ladder法對轉染細胞是否發(fā)生凋亡進行了檢測。實驗結果表明rLjGRIM19在Hela細胞和肝癌細胞HepG2中獲得了穩(wěn)定性表達