鯉魚Akirin基因的分子克隆及免疫功能研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是多細(xì)胞動物抵御細(xì)菌的重要防線。Akirin是一類由200個左右氨基酸殘基組成的小分子核蛋白，發(fā)現(xiàn)于果蠅天然免疫系統(tǒng)中，發(fā)揮免疫調(diào)控作用。Akirin同源基因廣泛存在于從低等多細(xì)胞生物到高等脊椎動物中，進(jìn)化上高度保守。已有的研究表明:Akirin在果蠅Imd通路和脊椎動物TLR通路下游，與NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，參與調(diào)控免疫相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，是天然免疫調(diào)控機制中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子，其過表達(dá)或缺失直接影響動物對細(xì)菌的

2、防御能力。
　　本文通過比較各物種Akirin1和Akirin2基因cDNA序列確定cDNA序列保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計引物，克隆得到鯉魚Akirin1、Akirin2基因的cDNA片段，然后采用RACE技術(shù)得到其全長cDNA，并對其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；采用RT-PCR方法檢測了Akirin1和Akirin2 mRNA在正常鯉魚肝臟、脾臟、前腸、后腸、鰓、頭腎、血液、肌肉、皮膚和口腔上皮等組織的分布。已有報道顯

3、示，Akirin1主要在肌肉生成過程中發(fā)揮作用，而Akirin2則參與天然免疫機制的調(diào)控。結(jié)合組織分布實驗結(jié)果分析，選擇Akirin2作為后續(xù)免疫功能研究的對象。采用Real-time PCR技術(shù)檢測了鰻弧菌浸泡刺激后鯉魚肝臟、脾臟、頭腎、前腸和后腸中Akirin2 mRNA水平的變化，從而驗證鯉魚Akirin在天然免疫調(diào)控中的作用。
　　鯉魚Akirin1基因cDNA全長1204 bp，由179 bp的5'非編碼區(qū)(5'-UTR

4、)，570 bp的開放閱讀框(ORF)和455 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)組成，其中ORF區(qū)編碼189個氨基酸的Akirin1肽鏈，23～27位序列KRRRC為核定位信號。鯉魚Akirin2基因cDNA全長1290 bp，由192 bp的5'非編碼區(qū)(5'-UTR)，555 bp的開放閱讀框(ORF)和543 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)組成，其中ORF區(qū)編碼184個氨基酸的Akirin2肽鏈，23～27位序列與Akiri

5、n1相同，為KRRRC的核定位信號。
　　序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，鯉魚Akirin1和Akirin2之間同源性為57.2％，其中鯉魚與斑馬魚相似性最高，二者Akirin1的相似性為97.9％，Akirin2的相似性為89.4％；在進(jìn)化樹中，脊椎動物與昆蟲等處于不同的分支上，脊椎動物分支上，Akirin1和Akirin2處于兩個平行分支，每個物種按親緣關(guān)系遠(yuǎn)近再分布于不同分支。由此看來，Akirin1和Akirin2各自存在進(jìn)化

6、保守性，推測二者功能也可能存在差異。
　　RT-PCR檢測表明，在正常鯉魚中，Akirin1 mRNA在除血液外的其他組織中表達(dá)量基本恒定，血液中Akirin1表達(dá)量較少；Akirin2 mRNA的表達(dá)水平在肝臟、脾臟、前腸和頭腎中較高，其次為鰓、肌肉和皮膚，在后腸和血液中的水平較低。
　　Real-time PCR檢測表明，鯉魚經(jīng)過鰻弧菌浸泡刺激后，各組織中Akirin2 mRNA的表達(dá)量都發(fā)生了明顯的上調(diào)，刺激后6小時A

7、kirin2 mRNA在各組織的表達(dá)量都達(dá)到最大值，其中肝臟中表達(dá)量達(dá)約為正常表達(dá)的2倍，其余組織表達(dá)量在1倍以上；之后表達(dá)量逐漸下降，肝臟、脾臟、頭腎中表達(dá)量下降較為明顯，而前腸、后腸則表現(xiàn)出下降趨勢，變化不明顯。
　　鯉魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，研究鯉魚的天然免疫機制，能夠豐富魚類免疫資料，為深入了解魚類疾病的發(fā)生機理提供理論依據(jù)，進(jìn)而提升淡水魚類免疫力，減少魚病的發(fā)生，創(chuàng)造一定的經(jīng)濟(jì)價值。本文克隆得到鯉魚Akirin1、A