鯉魚MyD88基因的分子克隆及功能的初步研究.pdf

1、天然免疫是機體防御微生物病原體入侵第一道防線，機體細胞通過表達不同的模式識別受體(PRRs)，來識別包括類脂，脂蛋白，蛋白和核酸在內(nèi)的各種病原相關分子模式(PAMPs)，激活機體細胞內(nèi)信號通路，誘導炎癥細胞因子和趨化因子及干擾素的表達。Toll樣受體(TLRs)家族是參與識別病原體相關分子模式(PAMPs)的模式識別受體(PRRs)之一，在天然免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，并且能夠激活適應性免疫，是聯(lián)系天然免疫和適應性免疫的橋梁。髓樣分

2、化因子88(MyD88)是白介素Ⅰ受體/Toll樣受體超家族胞內(nèi)信號通路中重要的接頭分子，介導除 TLR3外的TLRs信號通路。血清淀粉樣 A(Serum amyloid A，SAA)是TLR信號通路所誘導炎癥反應的效應分子，是一種主要的急性期蛋白。炎性刺激誘導炎癥反應發(fā)生時，細胞因子促進 SAA高度表達。
　　本研究以鯉魚為研究對象，采用分子克隆和SMART RACE技術獲得鯉魚MyD88 cDNA全長。根據(jù)已得到的cDNA序列

3、，設計跨 ORF引物，以DNA為模板，獲得 MyD88基因全長。MyD88 cDNA序列全長1728bp，包含3'非翻譯區(qū)870bp，858bp的開放閱讀框。MyD88基因全長3748bp，包含5個外顯子，4個內(nèi)含子。
　　用生物信息學方法對該序列進行結(jié)構和進化分析，MyD88基因序列的分析表明，鯉魚 MyD88基因編碼的蛋白質(zhì)由284個氨基酸組成，其分子量為32.86kDa、pI為5.79。利用在線軟件 SMART程序?qū)ν茖У陌?/p>

4、基酸序列分析其功能結(jié)構域，結(jié)果表明，該蛋白具有典型的MyD88結(jié)構，N端具有死亡結(jié)構域，中間的連接結(jié)構域和C末端的TIR結(jié)構域。同源分析表明，鯉魚 MyD88蛋白氨基酸序列也具有高度的保守性，其中TIR區(qū)相似性比 ORF和Death區(qū)都高，這與 TIR區(qū)的高度保守性有關。氨基酸結(jié)構分析、多序列比對和進化樹分析都表明，MyD88與其他物種 MyD88之間有較高的氨基酸相似性，與斑馬魚 MyD88(NM_212814)、牙鲆 MyD88(A

5、B241074)、人 MyD88(NM002468)、小鼠 MyD88(AAC53013)的相似性分別是86.0％、66.9％、60.4％以及59.6％。
　　對RNA進行定量分析后，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA第一鏈，進行半定量 RT-PCR，檢測鯉魚 MyD88在不同組織中的表達量，結(jié)果顯示MyD88基因在健康鯉魚的所選組織中均有所表達，其中在前腸、脾臟、頭腎、口腔上皮和性腺中表達量較高，后腸和肌肉組織中表達量