抑制MyD88促進(jìn)小鼠心臟與皮膚移植耐受及其機(jī)理.pdf

1、本文主要從以下三個(gè)方面展開(kāi)論述：
　　第一部分 MyD88抑制劑TJ-M2010對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　目的：探究新型MyD88抑制劑TJ-M2010對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞共刺激分子表達(dá)、吞噬功能、遷移能力、凋亡、刺激T細(xì)胞增殖等生物學(xué)功能方面的影響。
　　方法：體外誘導(dǎo)培養(yǎng)得到BALB/c小鼠不成熟骨髓源性 DC（bone marrow-derived dendritic cells, BMDC

2、s），分為四組：空白組（不做任何處理），CpG刺激組，CPG刺激+低濃度TJ-M2010組（20μM），CpG刺激+高濃度TJ-M2010組（40μM）。孵育24小時(shí)后流式檢測(cè)DC共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ和趨化因子受體CCR7的表達(dá)；westblot的方法檢測(cè)NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)；收集上述經(jīng)不同濃度TJ-M2010處理的BALB/c BMDC，與CFSE標(biāo)記的C57小鼠T細(xì)胞體外在CpG刺激下行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，3天

3、后流式檢測(cè) T細(xì)胞增殖情況。BALB/c BMDC中加入不同濃度TJ-M2010，利用FITC-Dextran法檢測(cè)DC吞噬功能，利用Annexin-Ⅴ-PI雙染法檢測(cè)DC凋亡及壞死情況。
　　結(jié)果：流式結(jié)果顯示：DC經(jīng)CpG刺激后高表達(dá) CD80/CD86/MHCⅡ（53.1±0.3％/55.6±3.5％/64.6±4.3％）。20μM、40μM TJ-M2010分別下降上述分子水平至（CD80：38.2％±2.2％,20.7％

4、±1.1％； CD86：40.4％±1.6％,26.3±1.5％； MHCⅡ：45.1％±2.4％,28.1±3.4％，p<0.05,vs CpG對(duì)照組）。DC經(jīng)CpG刺激后CCR7表達(dá)率由25.43％上升至46.86％，20μM、40μM TJ-M2010分別使 CCR7下降至36.07％和27.20％。TJ-M2010能夠劑量依賴(lài)性的抑制由 CpG引起的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位。TJ-M2010能夠劑量依賴(lài)性地抑制 BMDC與同種

5、反應(yīng)性 T細(xì)胞混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中CD3+CFSE+T細(xì)胞比例?？瞻捉MDC吞噬FITC-Dextran陽(yáng)性率為63.4％±3.4％，20μM、40μM TJ-M2010與 DC共孵育后，其 FITC-Dextran陽(yáng)性率未見(jiàn)明顯改變，分別為65.7％±2.6％和62.6％±2.6％(p>0.05， vs空白組）?？瞻捉M DC培養(yǎng)24小時(shí)后Annexin-Ⅴ-PI雙陽(yáng)細(xì)胞比例為：6.6％±0.9％，20μM、40μM TJ-M2010與DC

6、共孵育后， Annexin-Ⅴ-PI雙陽(yáng)細(xì)胞比例未見(jiàn)明顯改變，分別為：6.5％±1.1％和6.6％±1.1％（p>0.05，vs空白組）。
　　結(jié)論：TJ-M2010能夠劑量依賴(lài)性地抑制CpG引起的DC的成熟、高遷移能力及NF-κB活化，并能夠劑量依賴(lài)性地間接抑制同種反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增殖；TJ-M2010不影響DC吞噬功能，對(duì)DC也為見(jiàn)明顯細(xì)胞毒性作用。
　　第二部分 MyD88抑制劑TJ-M2010促進(jìn)小鼠同種異基因心臟移

7、植耐受及機(jī)制
　　目的：探討MyD88抑制劑TJ-M2010在誘導(dǎo)小鼠同種異基因心臟移植耐受中的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法：（1）建立BALB/c(H-2d)→C57BL/6(H-2b)的小鼠腹部心臟移植模型。實(shí)驗(yàn)分為三組：空白對(duì)照組，CMC溶媒對(duì)照組及TJ-M2010用藥組。TJ-M2010用0.5％羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl cellulose，CMC）混懸，腹腔注射給藥；對(duì)照組使用相同劑量的0.5％

8、 CMC腹腔注射。手術(shù)當(dāng)天記為Day0，TJ-M2010給藥方案為：Day-2~ Day7連續(xù)每天給藥，劑量50mg/kg/天。術(shù)后每天捫診移植心臟，觀察移植物存活時(shí)間。（2）術(shù)后7天獲取移植心，HE染色檢測(cè)各組移植物病理改變；利用Ⅱ型膠原酶消化移植物獲得移植物中單個(gè)核細(xì)胞，流式檢測(cè) CD11c+CD80+雙陽(yáng)細(xì)胞比例；實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)移植心中IL-1、IL-6、TNF-αmRNA水平。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植心長(zhǎng)期存活小鼠脾臟中

9、CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞比例；分離各組脾臟細(xì)胞，INF-γELISPOT檢測(cè)各組脾臟細(xì)胞抗原反應(yīng)性。（4）二次心臟移植：對(duì)移植物長(zhǎng)期存活小鼠行供者來(lái)源二次頸部心臟移植，觀察二次移植物存活時(shí)間。
　　結(jié)果：空白對(duì)照組（n=5）移植心存活時(shí)間MST為7.4±0.5天，CMC溶媒對(duì)照組（n=5）移植物MST為7.6±0.5天，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。而TJ-M2010組可使50％的移植心存活時(shí)間超過(guò)100天。對(duì)

10、移植物長(zhǎng)期存活的受者行二次心臟移植，受者可持續(xù)不排斥BALB/c心臟（>100天）。術(shù)后7天移植物病理顯示TJ-M2010組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、組織破壞等排斥反應(yīng)明顯輕于CMC對(duì)照組。實(shí)時(shí)定量熒光PCR示：與CMC溶媒對(duì)照組相比，TJ-M2010組移植心中IL-1、IL-6、TNF-αmRNA水平明顯降低（p<0.05）。同時(shí)TJ-M2010組移植心中單個(gè)核細(xì)胞CD11c+CD80+雙陽(yáng)細(xì)胞比例明顯低于CMC對(duì)照組。脾臟中Treg比例：CMC

11、對(duì)照組Treg比例為6.43％，TJ-M2010組Treg比例升高至12.92％。INF-γ ELISPOT顯示： TJ-M2010組移植物長(zhǎng)期存活小鼠脾臟細(xì)胞對(duì)C3H抗原反應(yīng)正常（p>0.05, VS未做心臟移植的B6脾臟細(xì)胞），而對(duì)BALB/c抗原反應(yīng)性明顯降低（p<0.05, VS未做心臟移植的B6脾臟細(xì)胞）。
　　結(jié)論：?jiǎn)为?dú)短期應(yīng)用MyD88抑制劑TJ-M2010能夠誘導(dǎo)供者特異性小鼠心臟移植耐受，機(jī)制上可能與減輕炎性因子

12、分泌、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等有關(guān)。
　　第三部分 MyD88抑制劑TJ-M2010聯(lián)合anti-CD154誘導(dǎo)小鼠同種異基因皮膚移植耐受
　　目的：探討MyD88抑制劑TJ-M2010聯(lián)合anti-CD154誘導(dǎo)小鼠同種異基因皮膚移植耐受的可能性及其機(jī)制。
　　方法:建立BALB/c(H-2d)→C57BL/6(H-2b)的小鼠皮膚移植模型。實(shí)驗(yàn)分為三組：TJ-M2010用藥組，anti-CD154組，TJ-M2010+a

13、nti-CD154組。手術(shù)當(dāng)天記為Day0， TJ-M2010給藥方案為：Day-2-Day7，Day9，Day11， Day13， Day15，腹腔注射，劑量50mg/kg/天。Anti-CD154(MR1 clone)給藥方案：Day0-Day3， Day7， Day14，腹腔注射，劑量200ug/只/次。以移植皮片完全壞死判斷為排斥時(shí)間點(diǎn)，觀察各組移植物存活時(shí)間。對(duì)移植物長(zhǎng)期存活小鼠行供者（BALB/c）及第三方（C3H）來(lái)源二次

14、皮膚移植或心臟移植，觀察二次移植物存活時(shí)間。分離移植物長(zhǎng)期存活小鼠脾臟中單個(gè)核細(xì)胞，流式檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞比例； INF-γELISPOT檢測(cè)各組脾臟細(xì)胞對(duì)供者（BALB/c）及第三方（C3H）抗原反應(yīng)性。
　　結(jié)果：TJ-M2010用藥組及anti-CD154組皮膚移植物存活時(shí)間分別為（9.0±0.71）天與（9.6±0.55）天，兩組之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05），而TJ-M2010+ant

15、i-CD154組可使22％的皮膚移植物長(zhǎng)期存活（>100天）。對(duì)移植物長(zhǎng)期存活的小鼠行二次心臟移植，心臟移植物全部長(zhǎng)期存活（>100天）；二次皮膚移植，BALB/c來(lái)源皮膚移植物存活時(shí)間為(16±1.4)天，C3H來(lái)源皮膚移植物存活時(shí)間為（13.5±0.7）天；行二次皮膚移植受體同時(shí)短期給予TJ-M2010，則BALB/c皮膚移植物存活時(shí)間可延長(zhǎng)至41天、72天（n=2）。脾臟中Treg比例：與對(duì)照組相比，TJ-M2010+anti-C

16、D154組Treg比例明顯升高。TJ-M2010+ anti-CD154組移植物長(zhǎng)期存活小鼠脾臟對(duì)C3H抗原反應(yīng)正常（p>0.05, VS未做皮膚移植的B6脾臟細(xì)胞），而對(duì)BALB/c抗原反應(yīng)性明顯降低（p<0.05, VS未做皮膚移植的B6脾臟細(xì)胞）。
　　結(jié)論：MyD88抑制劑TJ-M2010聯(lián)合anti-CD154可以誘導(dǎo)小鼠同種異基因皮膚移植耐受，此種耐受是一種不穩(wěn)定的耐受狀態(tài)，而MyD88分子在此種耐受的維持中發(fā)揮重要作