RNAi抑制大鼠骨髓源樹突狀細胞MyD88基因表達的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：應用RNAi(RNA interference)技術探討靶向MyD88的shRNA質粒載體抑制大鼠骨髓源樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)MyD88基因表達的可行性。
　　 方法：采用培養(yǎng)基選擇法經(jīng)體外培養(yǎng)大鼠骨髓源DC；流式細胞儀監(jiān)測DC表面抗原MHC-Ⅱ和OX-62表達情況；經(jīng)體外設計合成針對MyD88 mRNA序列特異性MyD88 shRNA3條，并分別構建于Pgenesil.1質粒，提取重組質粒進行酶

2、切鑒定并測序；實驗分為空白對照組、GenePorter3000組、pHK-shRNA組、pMvD881-shRNA組、pMyD882-shRNA組和pMyD883-shRNA組等六個組別。在陽離子脂質體轉染劑介導下轉染DC；熒光實時定量PCR檢測轉染后MyD88 mRNA表達水平的變化；WesternBlot技術檢測轉染后MyD88蛋白表達水平的變化。使用SPSS17.0 for Windows進行數(shù)據(jù)分析。
　　 結果：經(jīng)體外

3、培養(yǎng)，每只大鼠可獲得1.0×107個DC；經(jīng)測序結果分析，pMyD881-shRNA、pMyD882-shRNA、pMyD883-shRNA均為插入正確的克隆質粒；熒光實時定量PCR檢測顯示構建的3個pMyD88-shRNA質粒通過脂質體轉染大鼠骨髓源DC，均能不同程度地抑制MyD88的表達，與對照組具有顯著差異(P<0.01)，其中pMyD881-shRNA質粒組的抑制作用最為明顯，GenePorter3000組與pHK-shRNA質

4、粒對照組間MyD88的mRNA轉錄水平無顯著性差異(P>0.05)；WesternBlot檢測顯示3個MyD88-shRNA質粒組中DC轉染后MyD88蛋白的表達水平均較對照組明顯降低(P<0.01)，與對照組有顯著性差異，其中pMyD881-shRNA質粒組抑制蛋白表達作用最為明顯，空白對照組、GenePorter3000組與pHK-shRNA質粒對照組間MyD88蛋白表達水平無顯著性差異(P>0.05)；
　　 結論：經(jīng)體外

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