RNAi抑制Smad6并在TGF-β1作用下對(duì)小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性變化的研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的:探討體外擴(kuò)增小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞(BMDC)的方法并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生物學(xué)特性鑒定。
　　 方法:用重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組小鼠白細(xì)胞介素4(rmIL-4)體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞,倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面分子,同時(shí)進(jìn)行刺激初始型T淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)9天后小鼠樹突狀細(xì)胞可達(dá)80％以上

2、,光鏡下可見典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)。未成熟DC的細(xì)胞表型為CD11Clow、MHCIIlow、CD86low,未成熟Dc經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)后可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥C,細(xì)胞表型為CD11chigh曲、MHCIIhigh曲、CD86high,可顯著刺激同種異體混合淋巴細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)論:本方法可獲得較高純度的骨髓樹突狀細(xì)胞,避免了使用傳統(tǒng)磁珠分離方法所帶來(lái)的高成本,復(fù)雜操作,低產(chǎn)出率的弊端,為研究樹突狀細(xì)胞的功能以及運(yùn)用其開展下游實(shí)驗(yàn)提供材

3、料。
　　 第二部分：
　　 目的:使用已構(gòu)建成功的小鼠Smad6基因RNA干擾(RNAi)慢病毒載體,有效沉默骨髓樹突狀細(xì)胞(BMDC)的Smad6基因表達(dá)。
　　 方法:運(yùn)用構(gòu)建好的慢病毒載體,根據(jù)前期試驗(yàn)所明確的感染復(fù)數(shù)對(duì)第一部分所培養(yǎng)的小鼠BMDC進(jìn)行感染,120h后收集細(xì)胞,并經(jīng)倒置熒光顯微鏡、RT-PCR,WESTERN BLOT檢測(cè)Smad6基因的表達(dá)狀況。
　　 結(jié)果:熒光顯微鏡觀察初步推

4、斷病毒感染效率在75％左右,PCR和WESTERN BLOT證實(shí),通過(guò)病毒途徑,在BMDC細(xì)胞中smad6基因的沉默效約為85％。
　　 結(jié)論:通過(guò)使用慢病毒載體,較成功抑制小鼠BMDC中Smad6基因表達(dá)。說(shuō)明運(yùn)用慢病毒做RNAi載體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DC細(xì)胞某一基因的有效沉默。
　　 第三部分：
　　 目的:探討在Smad6基因被抑制并有TGF-β1刺激的情況下,小鼠骨SH髓源樹突細(xì)胞生物學(xué)特性是否存在著變化。

5、>　　 方法:分別以GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)兩批小鼠BMDC,其中一批經(jīng)用慢病毒感染,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Smad6基因抑制,6d后同時(shí)用TGF-β1刺激,再經(jīng)過(guò)48h后分別對(duì)兩批細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)其抗原提呈功能,檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,收集上清液用ELISA檢測(cè)IL-6,IL-12 p70。
　　 結(jié)果:Smad6未干擾組電鏡下DC成熟樣特征

6、較明顯,CD11c、CD80、CD86及MHCⅡ的表達(dá)水平也較高,細(xì)胞凋亡指數(shù)較低,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和分泌IL-4、IL-12 p70能力較強(qiáng),Smad6干擾組DC形態(tài)成熟特征不明顯,CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)水平較低,細(xì)胞凋亡指數(shù)較高,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和分泌IL-4、IL-12 p70能力較弱。
　　 結(jié)論:在小鼠BMDC中Smad6基因被抑制并有TGF-β1刺激的情況下,細(xì)胞多呈未成熟狀態(tài),以未成熟的生物