攜帶SOCS1基因腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性和功能的作用機(jī)制.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞,能夠啟動(dòng)初始T細(xì)胞活化、增殖、分化并產(chǎn)生免疫效應(yīng),在免疫系統(tǒng)中居于獨(dú)特的地位。成熟DCs能夠激發(fā)免疫應(yīng)答,而不成熟DCs則涉及免疫耐受的誘導(dǎo)。利用DC的免疫調(diào)節(jié)作用,誘導(dǎo)免疫耐受是當(dāng)前移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究表明,髓系未成熟DC亞群(immature DC subset,imDC)或靜息DC(resting DC)由于表面黏附輔佐分子如B7、ICAM-1、C

2、D40等缺乏,因此具有免疫耐受性,可以誘導(dǎo)T細(xì)胞失能(anergy)、低反應(yīng)性及向Th2細(xì)胞極化,并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)產(chǎn)生,未成熟DC的這些效應(yīng)對(duì)器官移植時(shí)免疫穩(wěn)定態(tài)的維持具有重要的作用。因此,研究調(diào)節(jié)DCs發(fā)育成熟的因素及其機(jī)制,對(duì)于闡明自身免疫病、移植排斥反應(yīng)、抗腫瘤免疫等的機(jī)制和探索防治措施有著重要的意義。 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(Supressors of cytokin

3、e signaling,SOCS)是1997年Starr、Endo和Naka所在的三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)小組,用不同的方法相繼發(fā)現(xiàn)的一類與細(xì)胞因子JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。SOCS能抑制ILs、IFN-γ、GH等多種細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,不僅對(duì)JAK-STAT信號(hào)途徑有負(fù)性調(diào)控作用,而且還參與其它信號(hào)途徑的調(diào)節(jié),其功能涉及機(jī)體正常組織的分化和器官的發(fā)育,因此為學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注。SOCS通過選擇性抑制IL-12/STAT4或

4、IL-4/STAT6途徑的信號(hào)傳導(dǎo),實(shí)現(xiàn)對(duì)Th細(xì)胞的分化調(diào)控,其平衡紊亂導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。 SOCS1為該家族中含SH2結(jié)構(gòu)域的SOCS成員之一,又稱JAB(JAK binding protein)或SSI1(STAT induced STAT inhibitor 1)。正常生理?xiàng)l件下,SOCS1蛋白分子表達(dá)量很少；在細(xì)胞受到某些細(xì)胞因子刺激時(shí),其表達(dá)量可迅速明顯地增加。研究表明當(dāng)機(jī)體受到刺激以后,SOCS1的mRNA在

5、胸腺細(xì)胞內(nèi)的豐度顯著增加；在肺、脾和睪丸等器官中等增加。在體外,SOCS1可以抑制多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑,在細(xì)胞中超表達(dá)時(shí)可以抑制IFNs、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-12、TNF-α、LIF、OSM(抑瘤素M)等細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。SOCS1通過抑制由ILs、IFN以及LIF等所誘導(dǎo)的STAT活性以及Tec激酶和受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)的活性,調(diào)控細(xì)胞的分化與功能。

6、 考慮到DC在抗原遞呈和免疫激活與耐受過程中的特殊作用,尤其是體內(nèi)imDC亞群的產(chǎn)生與細(xì)胞因子信號(hào)調(diào)控密切相關(guān),針對(duì)SOCS1負(fù)性調(diào)節(jié)IFN-γ、ILs等細(xì)胞因子信號(hào)的傳導(dǎo)可能對(duì)imDC亞群產(chǎn)生具有重要的作用,我們擬研究在DC分化、發(fā)育和抗原遞呈過程中,SOCS1的表達(dá)及對(duì)其影響的因素,探討SOCS1高表達(dá)對(duì)DC成熟、生物學(xué)特性和功能的影響,LPS等炎癥因子刺激在其中的作用,以及誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受的效果。目前對(duì)于SOCS1和DC之間相互關(guān)系

7、的研究主要集中在干擾SOCS1表達(dá)方面,而對(duì)于高表達(dá)SOCS1對(duì)DC的影響則鮮有報(bào)道。近期研究顯示,用RNA干擾技術(shù)沉默DC的SOCS1基因表達(dá),能促使DC成熟而增強(qiáng)其免疫原性。且Sakurai[49]等研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)SOCS1能夠明顯抑制腺病毒本身所誘導(dǎo)的初始免疫反應(yīng)。因此,在理論上用細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)上調(diào)DC的SOCS1基因表達(dá),能抑制DC成熟而增強(qiáng)其耐受原性。鑒于此,我們構(gòu)建了高表達(dá)SOCS1的腺病毒載體,轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源

8、的DC(BMDC),檢測(cè)BMDCs的表型、吞噬能力、細(xì)胞因子分泌以及刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力以及對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響,以驗(yàn)證SOCS1的高表達(dá)是否能夠抑制DC成熟并增強(qiáng)其耐受原性。 第一部分SOCS1腺病毒載體的構(gòu)建及其修飾的小鼠BMDC的制備 腺病毒載體因其具有基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、宿主細(xì)胞范圍廣、滴度高、感染效率高、無插入突變危險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì),因此我們選擇了AdEasyTM Adenoviral Vector System體

9、系構(gòu)建SOCS1載體。首先取經(jīng)過LPS刺激4小時(shí)后的小鼠脾臟,抽提其mRNA,然后根據(jù)報(bào)道及Genebank發(fā)布的基因和蛋白序列,設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物,RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增獲得小鼠SOCS1全長(zhǎng)基因序列,雙酶切后連接到AdEasyTM Adenoviral Vector System體系中的pShuttle-CMV中,然后與pAdeasy-1同源重組,在293A細(xì)胞中包裝出帶有SOCS1目的基因的腺病毒pAdes

10、y-SOCS1。通過PCR、酶切、測(cè)序鑒定及Westernblot檢測(cè),結(jié)果顯示,攜帶小鼠SOCS1基因的腺病毒載體可高表達(dá)SOCS1蛋白,說明帶有目的基因SOCS1的腺病毒構(gòu)建成功。經(jīng)過病毒的擴(kuò)增及滴度檢測(cè),我們構(gòu)建的小鼠pAdeasy-SOCS1腺病毒獲得了較高的滴度。 采用GM-CSF和IL-4共同刺激小鼠骨髓細(xì)胞,培養(yǎng)小鼠BMDC。此法培養(yǎng)的DC在5-7天時(shí)大部分為未成熟DC小集落,經(jīng)LPS、CpG或PolyI:C刺激2

11、4-36小時(shí)后,DC表面可伸出大量很長(zhǎng)的突起；經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè),BMDC的純度可以達(dá)到80％以上,符合實(shí)驗(yàn)的要求。實(shí)驗(yàn)分為三組：第一組正常BMDC組(DC only);第二組空病毒pAdeasyTM-VNG轉(zhuǎn)染小鼠BMDC,形成空病毒對(duì)照組(DC+pAdeasy-VNG);第三組將pAdeasyTM-SOCS1轉(zhuǎn)染BMDC,形成SOCS1高表達(dá)組(DC+pAdcasy-SOCS1)。普通顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SOCS1的BMDCs所形

12、成的集落明顯的小且突起少而鈍；熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大約80％BMDCs發(fā)出綠色熒光；同時(shí)RT-PCR和Westernblot檢測(cè)上述BMDCs的SOCS1基因和蛋白的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組SOCS1蛋白的表達(dá)明顯增多。但由于病毒載體的影響,與BMDCs相比,空病毒對(duì)照組也有少量的SOCS1蛋白的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的pAdeasy-SOCS1腺病毒能有效介導(dǎo)SOCS1基因在小鼠BMDCs中表達(dá),且空病毒可以誘導(dǎo)BMDCs微量的表達(dá)

13、SOCS1。 第二部分高表達(dá)SOCS1對(duì)BMDC生物學(xué)特性和功能的影響 在本部分,BMDCs被分為6組,施以不同的刺激條件。A組：培養(yǎng)過程中不加任何刺激的空白對(duì)照組(DC only);B組：培養(yǎng)第5天加入pAdeasyTM-VNG空病毒對(duì)照組(DC+pAdeasyTM-VNG);C組：培養(yǎng)第5天加入pAdeasyTM-SOCS1實(shí)驗(yàn)組(DC+pAdeasyTM-SOCS1);D組：培養(yǎng)過程中不加任何刺激的空白對(duì)照組,檢測(cè)

14、前24小時(shí)再加入LPS刺激(LPS+DC);E組：培養(yǎng)第5天加入pAdeasyTM-VNG空病毒對(duì)照組,檢測(cè)前24小時(shí)再加入LPS刺激(LPS+DC+pAdeasyTM-VNG組);F組：培養(yǎng)第5天加入pAdeasyTM-SOCS1檢測(cè)前24小時(shí)再加入LPS刺激(LPs+DC+pAdeasyTM-SOCS1組)。經(jīng)過FACS、ELISA等實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SOCS1,能夠明顯抑制BMDCs表面分子CD40、CD80、CD86和

15、MHC II分子的表達(dá)；BMDCs攝取抗原能力維持在高水平而刺激異記憶T細(xì)胞增殖能力不足；同時(shí)伴隨著IL-12p40、IL-6、IFN-γ、及TNF-α等細(xì)胞因子分泌水平的降低。空病毒組則恰恰相反,在一定程度上刺激了BMDCs的成熟。但高表達(dá)SOCS1能夠明顯抑制空病毒所誘導(dǎo)的BMDCs的成熟作用。 此外,NF-κB在TLR誘導(dǎo)的DC成熟過程中起十分重要作用,主要參與了細(xì)胞因子的分泌調(diào)節(jié)。SOCS1、P13K、PKCs等信號(hào)分子

16、通過NF-κB、p38MAPK和JNK的激活而調(diào)控DC的成熟和細(xì)胞因子的分泌。因此,我們選擇其中兩個(gè)重要的相關(guān)信號(hào)分子,即NF-κB和JNK,初步探索高表達(dá)SOCS1對(duì)BMDCs信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SOCS1的BMDCs中p65表達(dá)量明顯降低,JNK的表達(dá)量有所升高；而LPS刺激后高表達(dá)SOCS1的BMDCs中p65表達(dá)量略微降低,JNK的表達(dá)量明顯降低。因此,我們推測(cè)高表達(dá)SOCS1的BMDCs在信號(hào)調(diào)節(jié)的過程中,主要是