羅非魚髓樣分化因子(MyD88)的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、髓樣分化因子（MyD88）是IL-1R/TLR信號(hào)通路（TLR3除外）的關(guān)鍵接頭蛋白，可激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的產(chǎn)生，在天然免疫中具有重要作用。羅非魚作為重要的世界性養(yǎng)殖魚類，有關(guān)MyD88及其介導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)因子的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)RACE-RCR技術(shù)克隆了奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚MyD88基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩種羅非魚MyD88在不同組織中的表達(dá)。
　　 序列分析表明奧利亞

2、羅非魚MyD88 eDNA序列全長(zhǎng)1611bp，5'UTR為155bp，3'UTR為589 bp;尼羅羅非魚MyD88基因全長(zhǎng)為1572 bp，5'UTR為118 bp，3' UTR為587 bp;開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度均為867 bp，共編碼288個(gè)氨基酸。奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚MyD88核苷酸序列相似性高達(dá)99％。利用在線軟件SMART程序?qū)ν茖?dǎo)的氨基酸序列分析其功能結(jié)構(gòu)域，其結(jié)果表明，羅非魚MyD88蛋白具有典型的MyD88結(jié)構(gòu)，具有N

3、端的死亡結(jié)構(gòu)域，中間的連接結(jié)構(gòu)域和C末端的TIR結(jié)構(gòu)域;其中TIR結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)高度保守的區(qū)域:box1(FDAFICYCQ)，box2(LCVFDRDVLPGSC)，和box3(FWTRL)。同源性分析表明，羅非魚MyD88與其他物種MyD88之間有較高的氨基酸和編碼區(qū)序列相似性，與鱖魚氨基酸相似性高達(dá)85.8％，核苷酸相似性為84.7％，與其他魚類核苷酸相似性為69％～82％，與哺乳動(dòng)物核苷酸相似性為63％～64％;與無(wú)脊椎動(dòng)物扇貝

4、（核苷酸相似性31.8％,氨基酸相似性9.2％）、果蠅（核苷酸相似性21.9％，氨基酸相似性3.3％）的序列相似性最低。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，魚類MyD88聚為一支，與無(wú)脊椎動(dòng)物距離較遠(yuǎn);羅非魚MyD88與同屬鱸形目的鱖魚、大黃魚聚在一起，具有很近的親緣關(guān)系。
　　 為對(duì)羅非魚MyD88進(jìn)行組織定量檢測(cè)，根據(jù)所測(cè)羅非魚MyD88基因序列設(shè)計(jì)并合成特異性引物，以β-actin為內(nèi)參基因，建立了以SYBR Green染料為熒光指示劑的

5、MyD88實(shí)時(shí)定量PCR方法。實(shí)驗(yàn)以尼羅羅非魚肝臟組織eDNA為標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行5倍梯度稀釋，分別以3次平行重復(fù)和5個(gè)連續(xù)梯度稀釋樣品進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)兩基因PCR擴(kuò)增效率進(jìn)行判定。結(jié)果表明，MyD88和β-actin基因的擴(kuò)增效率分別為100％和96.7％，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.995;擴(kuò)增產(chǎn)物均形成單一的特異性熔解峰;而且MyD88和β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率差小于0.1，可認(rèn)為其擴(kuò)增效率基本一致，滿足應(yīng)用2

6、-△△Ct分析法進(jìn)行相對(duì)定量分析羅非魚MyD88表達(dá)的條件。為驗(yàn)證所建立的熒光實(shí)時(shí)定量PCR平臺(tái)，應(yīng)用相對(duì)定量2-△△Ct分析方法初步檢測(cè)了尼羅羅非魚肝臟、脾臟、血液和肌肉組織的相對(duì)表達(dá)量。組織相對(duì)定量初步分析結(jié)果顯示，MyD88基因在參與機(jī)體免疫的相關(guān)組織肝臟、脾臟和血液中高豐度表達(dá)，在肌肉組織中表達(dá)量較低。
　　 利用所建立的定量檢測(cè)羅非魚MyD88表達(dá)平臺(tái)，對(duì)健康奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚12種不同組織MyD88表達(dá)情況進(jìn)行

7、分析，分別進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)測(cè)定，并用Graphpad Prism5 Demo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，MyD88在所有被測(cè)組織中均有表達(dá)，奧利亞羅非魚與尼羅羅非魚MyD88各組織表達(dá)分布情況基本一致:在卵巢中表達(dá)水平最高，其次是小腸、脾臟、肝臟、腎臟、鰓和血液，肌肉、精巢組織中MyD88的表達(dá)水平最低。
　　 本文對(duì)羅非魚MyD88基因及其表達(dá)做了初步研究，推測(cè)羅非魚MyD88功能相似于其他魚類及哺乳動(dòng)物，參與機(jī)體免疫反應(yīng)。