豬瘟病毒NS5B蛋白與豬免疫應(yīng)答因子TRIF、MyD88和MAVS的多克隆抗體制備及其相互作用初探.pdf

1、豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病。豬瘟病毒NS5B蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白，具有RNA依賴的RNA多聚酶活性，能與3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。因此，制備豬瘟病毒NS5B蛋白多克隆抗體對進(jìn)一步研究豬瘟病毒NS5B蛋白與宿主免疫應(yīng)答因子的相互作用具有重要意義。
　　豬瘟病毒在感染宿主過程中會(huì)抑制Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)的產(chǎn)生，逃逸宿主的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致持續(xù)性感染。IFN-Ⅰ的產(chǎn)生受T

2、oll樣受體(TLR)信號通路和視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ受體(RLR)信號通路調(diào)控。在TLR信號通路中，主要通過接頭分子β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)和髓樣分化因子(MyD88)接收上游受體分子信號，將其傳遞給下游相關(guān)分子從而引起一系列級聯(lián)反應(yīng)。在RLR信號通路中，通過接頭分子線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)激活下游分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。目前生物制品市場上尚無這些抗體商品，沒有這些抗體就難以對豬瘟病毒與宿主的相互作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此

3、，制備TRIF、MyD88和MAVS的多克隆抗體將為進(jìn)一步研究豬瘟病毒感染后宿主TLR和RLR信號通路的調(diào)控機(jī)制或豬瘟病毒的免疫逃避機(jī)制打下良好基礎(chǔ)。
　　本研究通過RT-PCR擴(kuò)增并克隆了CSFV NS5B基因片段、豬TRIF、MyD88和MAVS基因ORF的部分序列，構(gòu)建了CSFV NS5B基因片段及TRIF、MyD88和MAVS基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，采

4、用Ni-NTA親和層析等方法進(jìn)行純化，純化的蛋白免疫昆明小鼠制備多克隆抗體，通過蛋白免疫印跡(Western Blot)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)驗(yàn)證所制備多克隆抗體的反應(yīng)性和特異性。本研究制備的多克隆抗體不僅與原核表達(dá)的重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，也與感染了CSFV的PK-15細(xì)胞表達(dá)的蛋白具有較高的特異性。用Western Blot檢測抗CSFV NS5B多克隆抗體與原核表達(dá)的NS5B重組蛋白反應(yīng)的稀釋度可達(dá)1∶8000，其他三個(gè)抗體與相應(yīng)

5、原核表達(dá)的重組蛋白反應(yīng)稀釋度可達(dá)1∶16000。用構(gòu)建的pcDNA3.0-NS5BFL真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，通過Western Blot和IFA均檢測到了瞬時(shí)表達(dá)的NS5B蛋白，IFA檢測的最佳工作濃度為1∶200。CSFV感染PK-15細(xì)胞后Western Blot檢測多抗的特異性，抗CSFV NS5B、TRIF、MyD88和MAVS多克隆抗體的最佳工作濃度分別為1∶2000、1∶1000、1∶500和1∶1000。

6、　　本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(qPCR)和Western Blot技術(shù)對感染1.0MOI CSFV后PK-15細(xì)胞中免疫應(yīng)答因子TRIF、MyD88和MAVS的mRNA和蛋白水平進(jìn)行了檢測。綜合上述實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)TRIF mRNA在感染豬瘟病毒后上調(diào)不顯著，其蛋白水平也未呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢;MAVS和MyD88mRNA分別在感染豬瘟病毒12和24h后顯著上調(diào)，其蛋白變化水平與mRNA水平一致。由此推測豬瘟病毒感染PK-15細(xì)胞后激活