豬瘟病毒C、NS3蛋白多克隆抗體的制備及其與IRG6相互作用的初步探索.pdf

1、豬瘟病毒(CSFV, Classicsl swine fever virus)是引起豬的高度傳染性致死性疾病——豬瘟的病原。CSFV感染可導(dǎo)致豬嚴(yán)重的白血球減少癥、免疫抑制、廣泛的血栓癥和內(nèi)皮損傷，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的威脅和經(jīng)濟(jì)損失。CSFV是一種小囊膜、單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科、瘟病毒屬，基因組約12.5kb，只有1個(gè)大的開(kāi)放閱讀框架（ORF,Open reading frame），所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由該ORF所編碼

2、，編碼的多聚蛋白約4000個(gè)氨基酸殘基，分子量約438kDa，在細(xì)胞和病毒蛋白酶的加工、修飾下形成12種成熟的病毒蛋白。
　　本研究小組先前的研究證實(shí)，在豬瘟病毒感染的過(guò)程中IRG6（Inflammatory response gene6 protein）的mRNA表達(dá)量一直處在非常高的水平。通過(guò)NCBI BLAST系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，在基因結(jié)構(gòu)上IRG6與其他物種的viperin有非常高的同源性，達(dá)到83.7％，主要功能區(qū)域的同源性達(dá)到9

3、0％。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能是密不可分的，IRG6與viperin結(jié)構(gòu)上的高度同源性提示其必然在功能上與viperin有著高度相似性。在感染豬瘟病毒過(guò)程中，IRG6的mRNA高水平表達(dá)也說(shuō)明其與豬瘟病毒感染的密切關(guān)系。
　　本文通過(guò)亞克隆的方法以pET-32a(+)原核表達(dá)載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了pET-C和pET-NS3原核表達(dá)質(zhì)粒。將pET-C和pET-NS3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，成功獲得重組蛋白C和NS3

4、。通過(guò)Ni2+的親和層析法純化了重組蛋白C和NS3，并將以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白NS3進(jìn)行了復(fù)性，制備出可溶性抗原，將重組蛋白C和NS3免疫小鼠制備出抗C蛋白和NS3蛋白蛋白多克隆抗體。Western blot檢測(cè)C蛋白和NS3蛋白多克隆抗體，二者能夠分別與重組蛋白C和NS3發(fā)生良好反應(yīng)。進(jìn)一步檢測(cè)多克隆抗體的特異性和反應(yīng)性，C蛋白多克隆抗體和NS3蛋白多克隆抗體能與天然構(gòu)象的豬瘟病毒C蛋白和NS3蛋白結(jié)合，兩種抗體的最適稀釋度均達(dá)到