FOXP3相互作用新分子——C22orf37的克隆表達(dá)純化及其抗體制備.pdf

1、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)在免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)及自身免疫耐受中發(fā)揮著非常重要的作用,其與機(jī)體的免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)狀態(tài)、自身免疫性疾病、移植物免疫排斥反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生有極其密切的聯(lián)系。正常情況下,免疫系統(tǒng)在對(duì)病原體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的同時(shí)，亦能避免產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的病理性反應(yīng)，這一現(xiàn)象的機(jī)制受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。中樞耐受機(jī)制不足以完全清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞。外周耐受機(jī)制，包括T細(xì)胞凋亡、免疫無能、效應(yīng)T細(xì)胞分化和

2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Tr)，在預(yù)防免疫病理反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。其中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用尤為重要。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要功能是抑制其他T細(xì)胞的活化，能夠阻止針對(duì)自身抗原的炎癥反應(yīng)。并能夠限制自身免疫病的發(fā)展。
　　目前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化起到重要的作用，近年的研究顯示,forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子FOXP3(forkhead/winged 2 helixtranscription fa

3、ctor),特異表達(dá)于該細(xì)胞,可作為Treg的特異分子標(biāo)記物,對(duì)該細(xì)胞的發(fā)育和功能起著重要調(diào)控作用。FOXP3(the forkhead or winged helix transcription)是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。2001年，Bnmkow等對(duì)Scurfy小鼠(小鼠FOXP3基因編碼的蛋白質(zhì)也稱為Scurfy)研究時(shí)首次報(bào)道FOXP3。同年，Wildin和Bennett提出人類FOXP3基因與Scurfy小鼠FOXP3基因具有

4、同源性。FOXP3的缺乏將導(dǎo)致致命的自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性疾病的發(fā)生,且異位FOXP3的表達(dá)能使效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,變?yōu)門reg細(xì)胞。因此，F(xiàn)oxp3在免疫系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)中發(fā)揮非常重要的作用。
　　Foxp3的兩個(gè)亞型（Foxp3FL和Foxp3△2）在人CD4+CD25+Treg中均表達(dá)，并且它們都具有賦予CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Treg的活性，但是目前關(guān)于Foxp3的作用機(jī)制尚未闡明。鑒于絕大多數(shù)分

5、子在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行功能都是通過蛋白與蛋白之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)，因此相互作用分子的研究為其機(jī)制的闡明提供了線索。目前已知的Foxp3相互作用分子有NFAT、NF-кB、AML1/Runx1、AP-1、RORγt和TIP60，對(duì)這些分子的研究已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，但是僅僅圍繞對(duì)這些分子的研究并不能充分闡明Foxp3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，所以對(duì)未知的Foxp3相互作用分子的進(jìn)一步探討是Foxp3轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的熱點(diǎn)。
　　我們前期通過酵母雙雜交技術(shù)

6、以FOXP3為誘餌，篩選了人外周血白細(xì)胞cDNA文庫中與之相互作用的分子，其中C22orf37是我們獲得的能與其發(fā)生物理相互作用的分子之一，經(jīng)Genbank檢索及生物信息學(xué)軟件分析，該基因?yàn)楣δ芪粗男禄颉?br>　　對(duì)于新基因功能研究而言，抗體的制備是其功能研究的首要必備因素。因此本課題首先應(yīng)用PCR方法從人外周血白細(xì)胞cDNA文庫中獲得人C22orf37基因，構(gòu)建人C22orf37融合表達(dá)載體，隨后誘導(dǎo)表達(dá)His-C22orf37

7、融合表達(dá)蛋白并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Western Blot鑒定，結(jié)果顯示，此分子在原核載體中有表達(dá)，然后應(yīng)用鎳螯合層析法純化重組融合蛋白，并對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行純度分析，純度達(dá)80％，最后用純化蛋白免疫BALB/c小鼠。通過ELISA檢測了血清中抗C22orf37抗體的效價(jià)。獲得了抗體效假高達(dá)1：10000。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了人C22orf37的融合蛋白原核表達(dá)載體并完成了人C22orf37融合蛋白的表