豬瘟病毒熒光抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起豬的一類具有高度危害性的傳染病，具有高度接觸性、傳播快速的臨床特點(diǎn)。在當(dāng)前的養(yǎng)殖過程中，由于疫苗的不恰當(dāng)使用和病毒自身變異等因素，豬瘟的流行發(fā)生了改變，在豬群中該病從大規(guī)模的流行轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫陨l(fā)，在個(gè)體豬只中該病多以非典型性、慢性及隱性形式出現(xiàn)，這種非典型性、慢性及隱性帶毒常常會(huì)出現(xiàn)在母豬群中，造

2、成妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，同時(shí)也會(huì)造成母豬的垂直傳播及豬群中水平傳播，從而給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的危害。本研究通過制備抗豬瘟病毒單克隆熒光抗體，旨在為豬瘟病毒的檢測(cè)提供一種快速而又敏感的檢測(cè)試劑。具體研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴豬瘟病毒單克隆熒光抗體的制備。復(fù)蘇和擴(kuò)大培養(yǎng)由本實(shí)驗(yàn)室研制的豬瘟主要保護(hù)性抗原E2囊膜蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞AH9株，通過Babl/c小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，大量制備了豬瘟單克隆抗體，運(yùn)用辛酸-

3、硫酸銨法與Sephadex G-25快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，得到濃度較高的豬瘟單克隆抗體(蛋白濃度為11.491 mg/mL)。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，在25kDa和50kDa處可以看到兩條清晰的條帶，證明純化后的豬瘟單克隆抗體純度高。運(yùn)用ELISA法對(duì)該單克隆抗體的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，效價(jià)為1∶51200。以異硫氰酸熒光素(FITC)為標(biāo)記物，采用透析法進(jìn)行標(biāo)記，成功制備了免疫熒光豬瘟病毒單克隆抗體檢測(cè)試劑。
　　 ⑵豬瘟病毒

4、單克隆熒光抗體最佳試驗(yàn)條件的摸索。通過對(duì)固定劑及固定時(shí)間的確定、抗體工作濃度的確定、抗體孵育時(shí)間的確定、特異性實(shí)驗(yàn)、敏感性實(shí)驗(yàn)、符合對(duì)比性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、保存期實(shí)驗(yàn)等試驗(yàn)條件摸索。最終我們確定最佳實(shí)驗(yàn)條件為:固定條件為60％丙酮+40％乙醇在-20℃下固定30min;抗體最佳工作濃度為1∶300;最佳抗體孵育時(shí)間為60min;與豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬乙腦病毒等其它常見病原無交叉反應(yīng)，特異性好;該方法與Re

5、al-time PCR樣品檢出率敏感性相差2個(gè)數(shù)量級(jí)，與RT-Nested PCR樣品檢出敏感性相差1個(gè)數(shù)量級(jí)，表明用此熒光抗體作為檢測(cè)試劑具有較高的敏感性;對(duì)已知背景的95份樣品分別采用直接免疫熒光和RT-Nested試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)定其符合率，結(jié)果顯示兩種檢測(cè)方法的總符合率達(dá)到88.42％，方法間符合率較高;重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法的重復(fù)性較好;保存期實(shí)驗(yàn)顯示，將該熒光抗體于-20℃保存6個(gè)月后體依然具有很高的特異性和敏感性。