豬瘟病毒熒光抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起豬的一類具有高度危害性的傳染病，具有高度接觸性、傳播快速的臨床特點。在當前的養(yǎng)殖過程中，由于疫苗的不恰當使用和病毒自身變異等因素，豬瘟的流行發(fā)生了改變，在豬群中該病從大規(guī)模的流行轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫陨l(fā)，在個體豬只中該病多以非典型性、慢性及隱性形式出現(xiàn)，這種非典型性、慢性及隱性帶毒常常會出現(xiàn)在母豬群中，造

2、成妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，同時也會造成母豬的垂直傳播及豬群中水平傳播，從而給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的危害。本研究通過制備抗豬瘟病毒單克隆熒光抗體，旨在為豬瘟病毒的檢測提供一種快速而又敏感的檢測試劑。具體研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴豬瘟病毒單克隆熒光抗體的制備。復(fù)蘇和擴大培養(yǎng)由本實驗室研制的豬瘟主要保護性抗原E2囊膜蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞AH9株，通過Babl/c小鼠腹腔注射雜交瘤細胞，大量制備了豬瘟單克隆抗體，運用辛酸-

3、硫酸銨法與Sephadex G-25快速蛋白純化系統(tǒng)進行純化，得到濃度較高的豬瘟單克隆抗體(蛋白濃度為11.491 mg/mL)。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在25kDa和50kDa處可以看到兩條清晰的條帶，證明純化后的豬瘟單克隆抗體純度高。運用ELISA法對該單克隆抗體的效價進行測定，效價為1∶51200。以異硫氰酸熒光素(FITC)為標記物，采用透析法進行標記，成功制備了免疫熒光豬瘟病毒單克隆抗體檢測試劑。
　　 ⑵豬瘟病毒

4、單克隆熒光抗體最佳試驗條件的摸索。通過對固定劑及固定時間的確定、抗體工作濃度的確定、抗體孵育時間的確定、特異性實驗、敏感性實驗、符合對比性實驗、重復(fù)性實驗、保存期實驗等試驗條件摸索。最終我們確定最佳實驗條件為:固定條件為60％丙酮+40％乙醇在-20℃下固定30min;抗體最佳工作濃度為1∶300;最佳抗體孵育時間為60min;與豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬乙腦病毒等其它常見病原無交叉反應(yīng)，特異性好;該方法與Re

5、al-time PCR樣品檢出率敏感性相差2個數(shù)量級，與RT-Nested PCR樣品檢出敏感性相差1個數(shù)量級，表明用此熒光抗體作為檢測試劑具有較高的敏感性;對已知背景的95份樣品分別采用直接免疫熒光和RT-Nested試驗進行檢測，以評定其符合率，結(jié)果顯示兩種檢測方法的總符合率達到88.42％，方法間符合率較高;重復(fù)性實驗結(jié)果顯示該方法的重復(fù)性較好;保存期實驗顯示，將該熒光抗體于-20℃保存6個月后體依然具有很高的特異性和敏感性。