固有免疫信號(hào)因子MyD88和TRIF在CC14致大鼠肝纖維化模型中的表達(dá).pdf

1、越來(lái)越多的研究顯示，肝臟在慢性炎癥性損傷之后繼發(fā)肝纖維化，而炎癥反應(yīng)在肝纖維化形成與發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用。酒精、病原微生物以及其它相關(guān)炎性反應(yīng)物也能激活機(jī)體免疫系統(tǒng)誘發(fā)炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的形成。在肝臟炎癥反應(yīng)急性期與慢性期，肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于損傷部位，參與介導(dǎo)急性期的免疫性炎癥反應(yīng)和損傷組織的修復(fù)反應(yīng)。
　　Toll受體是一個(gè)能感知病原體并直接作出防御性反應(yīng)的

2、天然免疫受體。主要包括MyD88和TRIF兩種主要的信號(hào)因子通路。所有的TLR適配器在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上都具有重要的積極作用。有研究顯示，肝細(xì)胞上表達(dá)一些可以被炎癥或前炎性因子調(diào)節(jié)的TLRs。肝細(xì)胞表面TLR的表達(dá)在肝臟疾病的發(fā)生及其所致的肝細(xì)胞損傷中亦起著重要的作用。包括LPS與其受體TLR4結(jié)合，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答，從而促成了纖維化的發(fā)生。因此，TLRs在肝纖維化的形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。但是目前

3、的研究主要集中于上游信號(hào)，而對(duì)固有免疫下游信號(hào)因子在肝纖維化中表達(dá)的特點(diǎn)和規(guī)律報(bào)道很少。
　　MyD88和TRIF作為重要信號(hào)通路，但對(duì)其表達(dá)變化的特點(diǎn)目前仍然不太清楚。因此，針對(duì)Toll下游重要信號(hào)因子MyD88和TRIF表達(dá)與作用特點(diǎn)的研究，對(duì)探討肝纖維化的發(fā)病機(jī)制及治療中具有重要意義。
　　研究目的
　　觀察固有免疫信號(hào)因子MyD88在肝纖維化大鼠肝臟中的表達(dá)特點(diǎn)，探討MyD88與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。研究固有

4、免疫信號(hào)因子TRIF在肝纖維化大鼠肝臟中細(xì)胞形態(tài)學(xué)表達(dá)特點(diǎn)、基因和蛋白表達(dá)規(guī)律，探討TOLL樣受體下游重要的信號(hào)因子TRIF與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制關(guān)系。
　　方法
　　1.造模與取材：將40只SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(10只)和實(shí)驗(yàn)組(30只)。實(shí)驗(yàn)組大鼠給予自行配制的高脂低蛋白飼料(包含39.5％玉米面+40％面粉+20％豬油+0.5％膽固醇)，同時(shí)給予實(shí)驗(yàn)組大鼠背部皮下注射CC14油劑，每周2次，共計(jì)12周。第一

5、周的2次皮下注射劑量皆為0.5ml/100g體重，以后每次注射劑量為0.3ml/100g體重，安排每周星期2和星期5進(jìn)行。每天10％酒精作為唯一飲料。正常對(duì)照組大鼠正常普通飼料喂養(yǎng)。取材：在無(wú)菌無(wú)熱源條件下，從大鼠腹主動(dòng)脈采血，注入加有肝素的無(wú)熱源玻璃試管中，離心取血漿置于玻璃試管中封口，低溫保存。取新鮮肝左葉一部分立即固定于4％多聚甲醛，24 h內(nèi)進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋；一部分置于-80℃保存。
　　2.HE染色：肝組織石蠟切

6、片進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察肝臟病變。
　　3.免疫組化檢測(cè)：標(biāo)本常規(guī)脫蠟、梯度脫水、過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸熱修復(fù)。山羊血清封閉(1％TritonX-100)15分鐘。兔抗MyD88，按1:50稀釋作為一抗，4℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育60分鐘，PBS沖洗，DAB顯色、脫水、透明、封片后鏡檢。
　　4.RT-PCR法檢測(cè)黑質(zhì)MyD88的表達(dá)：提取大鼠肝臟總RNA，然后在42℃條件下逆轉(zhuǎn)錄20分鐘，產(chǎn)物為cD

7、NA。擴(kuò)增反應(yīng)，PCR產(chǎn)物電泳。凝膠成像儀采圖，Quantityone one圖像分析軟件分析。
　　5電鏡標(biāo)本制作與檢測(cè)
　　用10 g/L戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注入麻醉大鼠，取出肝臟用0.1 mol/L的PBS溶液沖洗，切成小的組織片，放入2％多聚甲醛.2.5％戊二醛預(yù)固定。冷緩沖液漂洗15 min×3次，1％餓酸常溫固定2 h按照電鏡常規(guī)包埋、切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色，HitachiS-7500

8、透射電鏡觀察。
　　6.Western blot檢測(cè)：裂解肝組織，BCA法蛋白定量，積層膠和分離膠電泳，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，脫脂奶粉室溫封閉，兔抗MyD88多克隆抗體4℃過(guò)夜，PBST洗后，加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫2h，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)與軟件分析。
　　7.大鼠行為學(xué)觀察：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察各組大鼠行為學(xué)的變化，判斷是否有異常表現(xiàn)。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用()±s表

9、示，多組間比較先進(jìn)行單因素方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者進(jìn)行方差分析，方差不齊者進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，P<0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1.行為學(xué)評(píng)價(jià)：正常對(duì)照組大鼠健康狀況良好，精神狀態(tài)佳，體重正常，飲食正常，毛質(zhì)光亮。取出肝的標(biāo)本可見(jiàn)肝面潤(rùn)滑紅潤(rùn)，質(zhì)地柔軟；而模型組大鼠的活動(dòng)量下降，飲食減少，毛質(zhì)無(wú)光澤晦暗，精神不佳，體重明顯F降。取出肝臟灰暗有積結(jié)，重量增加。
　　2.免疫組化檢測(cè)結(jié)果：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)排列規(guī)則

10、有序，未見(jiàn)異常細(xì)胞等結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。在正常肝臟細(xì)胞中，肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞微弱表達(dá)，MyD88和TRIF的表達(dá)主要集中于一些枯否細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)性肝細(xì)胞。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，數(shù)量明顯減少，結(jié)構(gòu)紊亂無(wú)序，代之以大量異常細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維增生等特點(diǎn)。MyD88和TRIF表達(dá)明顯增加，內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞等都有強(qiáng)烈表達(dá)，并且以胞核表達(dá)為主，而陽(yáng)性與陰性對(duì)照沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)。
　　3.RT-PCR檢測(cè)MyD88 mRNA的表

11、達(dá)：與正常對(duì)照組相比，肝纖維化組MyD88 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有顯著性意義(*p<0.01)。
　　4.Western blot檢測(cè)MyD88和TRIF蛋白的表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，肝纖維化組MyD88和TRIF蛋白表達(dá)明顯升高，差異有顯著性意義(*p<0:01)。
　　5.透射電鏡結(jié)果檢測(cè)
　　正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞胞膜完整，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核圓且居中，核仁明顯。肝竇周間隙未見(jiàn)纖維沉積，脂滴少見(jiàn)；與正常對(duì)照組相比

12、，肝纖維化組可見(jiàn)高密度物質(zhì)，肝細(xì)胞周圍有大量膠原纖維沉積現(xiàn)象。竇周纖維化以及狄氏間隙擴(kuò)張明顯，并且可見(jiàn)成脂細(xì)胞；胞質(zhì)可見(jiàn)明顯的溶解現(xiàn)象，在狄氏腔內(nèi)，肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞核溶解，血竇內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)、胞核皆溶解。
　　結(jié)論
　　1.MyD88基因和蛋白表達(dá)在肝纖維化中顯著增強(qiáng)，在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞都有明顯表達(dá)分布，說(shuō)明MyD88可能在纖維化形成中起重要作用。
　　2.TRIF蛋白表達(dá)在肝纖維化中顯著增強(qiáng)，在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非