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文檔簡(jiǎn)介
1、視神經(jīng)在眼眶內(nèi)活動(dòng)程度受限,以致在頭部受到外力沖擊時(shí)極易造成直接和間接的原發(fā)性損傷,以及其后產(chǎn)生的包括血管痙攣或栓塞導(dǎo)致視神經(jīng)的缺血、變性或壞死,以及免疫與炎性反應(yīng)等繼發(fā)性損害。髓樣分化因子88(MyD88)是多種固有免疫受體在細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白,其依賴途徑參與脊髓損傷與修復(fù),在腦損傷后的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。視神經(jīng)同屬中樞神經(jīng)系統(tǒng),因此我們認(rèn)為MyD88可能是調(diào)控視神經(jīng)創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的靶點(diǎn),對(duì)視神經(jīng)損傷的修復(fù)發(fā)揮重要作用。
本
2、研究分以下四個(gè)部分:(1)成年SD大鼠視神經(jīng)夾傷/離斷模型的建立與改良;(2)阻斷MyD88通路對(duì)成年大鼠視神經(jīng)離斷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)存活的影響;(3)阻斷MyD88通路對(duì)成年大鼠視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)干中TLR4、NF-κB表達(dá)的影響;(4)阻斷MyD88通路對(duì)成年大鼠視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)干中GAP-43表達(dá)的影響。
第一部分:成年大鼠視神經(jīng)夾傷與離斷模型的建立和改良
成年大鼠視神經(jīng)夾傷/離斷模型已趨成熟,在
3、相關(guān)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛。然而,既往建模手術(shù)方法繁瑣,難度較大,手術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng),加之目前常用的單一麻醉方法容易造成大鼠呼吸抑制而死亡。本文作者在建立視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型時(shí),在開創(chuàng)部位、操作方法和麻醉方法等方面進(jìn)行了改良。
結(jié)論:以戊巴比妥和陸眠寧聯(lián)合麻醉取代單一戊巴比妥鈉麻醉,并使用可產(chǎn)生恒定夾傷力的特制動(dòng)脈瘤夾,能夠縮短手術(shù)時(shí)間,并降低手術(shù)難度和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率。
第二部分:阻斷MyD88通路對(duì)視神經(jīng)離斷后RGCs存
4、活的影響
方法:成年大鼠左側(cè)視神經(jīng)離斷后隨機(jī)分為三組:(1)MIP實(shí)驗(yàn)組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射MyD88抑制肽;(2)CP對(duì)照組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射對(duì)照肽;(3)PBS對(duì)照組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射PBS緩沖液。術(shù)后14d處死各組大鼠,視網(wǎng)膜取材,4%多聚甲醛后固定后視網(wǎng)膜全鋪片,計(jì)數(shù)熒光金逆行標(biāo)記的RGCs并計(jì)算出存活RGCs平均密度。
結(jié)果:MIP實(shí)驗(yàn)組存活節(jié)細(xì)胞平均密度(1206±134/mm2)較 CP對(duì)照組(90
5、8±112/mm2)和PBS對(duì)照組(879±123/mm2)顯著增高(p<0.01),而CP和PBS兩對(duì)照組間無顯著差異(p>0.05)。
結(jié)論:阻斷MyD88通路對(duì)成年大鼠視神經(jīng)損傷后的RGCs具有神經(jīng)保護(hù)作用。
第三部分:阻斷MyD88通路對(duì)夾傷視神經(jīng)干中TLR4和NF-kB表達(dá)的影響
方法:成年大鼠左側(cè)視神經(jīng)夾傷后隨機(jī)分為四組:(1)MIP實(shí)驗(yàn)組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射MyD88抑制肽;(2)CP對(duì)照組:
6、左眼玻璃體腔內(nèi)注射對(duì)照肽;(3)PBS對(duì)照組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射PBS緩沖液;(4)空白對(duì)照組:視神經(jīng)夾傷后未予任何處理。于視神經(jīng)損傷后1d、3d、7d或14d處死動(dòng)物,視神經(jīng)干取材行蛋白質(zhì)免疫印記(Western Blot)實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果:(1)與空白對(duì)照組相比,MIP實(shí)驗(yàn)組、CP對(duì)照組和PBS對(duì)照組TLR4蛋白表達(dá)量在1d、3d、7d及14d所有時(shí)間點(diǎn)均顯著增高(p<0.01);在術(shù)后1d時(shí)間點(diǎn),MIP實(shí)驗(yàn)組、CP對(duì)照組和P
7、BS對(duì)照組間TLR4蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05);當(dāng)術(shù)后存活時(shí)間升至3d、7d及14d時(shí),MIP實(shí)驗(yàn)組較CP對(duì)照組及PBS對(duì)照組TLR4蛋白表達(dá)量顯著降低(p<0.01),而CP對(duì)照組和PBS對(duì)照組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。(2)與空白對(duì)照組相比,MIP實(shí)驗(yàn)組、CP對(duì)照組和PBS對(duì)照組NF-κB蛋白表達(dá)量在1d、3d、7d及14d所有時(shí)間點(diǎn)均顯著增高(p<0.01);MIP組NF-κB表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)較CP對(duì)照組和PB
8、S對(duì)照組均有顯著降低(p<0.01),但CP對(duì)照組和PBS對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)的NF-κB表達(dá)量并無明顯差異(p>0.05)。
結(jié)論:早期阻斷MyD88通路對(duì)視神經(jīng)損傷后RGCs的保護(hù)作用,與TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)的下調(diào)相關(guān)。
第四部分:阻斷MyD88通路對(duì)夾傷視神經(jīng)干中GAP-43表達(dá)的影響
第四部分采用夾傷模型的建造及處理方法,分為四組,即完全空白對(duì)照的Con組、以及經(jīng)手術(shù)和術(shù)后玻璃體注射處理的MIP
9、組、CP組及PBS組。待模型制造完成后于1d、3d、7d及14d不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠處死進(jìn)行視神經(jīng)干的取材。視神經(jīng)干組織直接存放于-70℃冰箱待進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果:在視神經(jīng)損傷后1d、3d、7d及14d所有時(shí)間點(diǎn),MIP實(shí)驗(yàn)組、CP對(duì)照組和PBS對(duì)照組GAP-43蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組相比均顯著增高(p<0.01),MIP實(shí)驗(yàn)組較CP對(duì)照組和PBS對(duì)照組GAP-43蛋白表達(dá)量顯著增高(p<0.01),而CP對(duì)
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