Notch1通路在人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中對Toll樣受體4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景:鈣化性主動脈瓣疾病是老年人群中一種常見的疾病。隨著社會人口老齡化的進(jìn)展，鈣化性主動脈瓣疾病發(fā)病率正逐年上升，目前已經(jīng)發(fā)展成為僅次于冠心病和高血壓病的第三大心血管疾病。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為鈣化性主動脈瓣疾病是“退行性”改變，是機(jī)體老化的一種體現(xiàn)，是退行性鈣磷沉積不可修復(fù)的過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)鈣化性主動脈瓣疾病的發(fā)展可能是高度調(diào)節(jié)的自主過程，可能存在著一個復(fù)雜的多步驟的內(nèi)在機(jī)制在發(fā)揮作用，而并非年齡導(dǎo)致的不可避免的結(jié)果，病變有可能通過藥物

2、逆轉(zhuǎn)。由于發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前臨床上還沒有針對該病的治療性藥物，因此對該病發(fā)病機(jī)制的研究顯得尤其重要。越來越多研究證明了炎癥在鈣化性主動脈瓣疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。首先，通過對瓣膜置換手術(shù)中被置換出來的主動脈瓣膜進(jìn)行組織病理分析發(fā)現(xiàn)有炎癥的證據(jù)。其次，由于在發(fā)生主動脈瓣鈣化并狹窄的瓣膜里發(fā)現(xiàn)有與口腔感染一致的細(xì)菌證據(jù)，并且在實驗兔子接種口腔細(xì)菌可以誘導(dǎo)出主動脈瓣病變，推測慢性口腔感染可能是主動脈瓣鈣化和狹窄發(fā)病的重要機(jī)制之一

3、。
　　 人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞是主動脈瓣膜最主要的細(xì)胞成分，而主動脈瓣鈣化往往發(fā)生在瓣膜的間質(zhì)部分，因此人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞在鈣化性主動脈瓣膜疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。Toll樣受體(TLRs)是識別病原微生物的跨膜受體家族，主要通過識別保守的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)感知病原微生物的存在，對之產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)，在人類天然免疫系統(tǒng)中起到重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動物中存在有13種TLRs，而TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)且被研究最多

4、的TLR，廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等多種細(xì)胞中。TLR4被生物配體識別及結(jié)合后，可以活化細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。因此，TLR4在細(xì)胞的免疫與炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。近來研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞能夠表達(dá)有功能的TLR4，刺激這種受體后能夠引起心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的炎癥和成骨反應(yīng)，這在鈣化性主動脈瓣疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程中起重要作用。間質(zhì)細(xì)胞的炎癥激活可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集和浸潤

5、，而炎癥介質(zhì)促進(jìn)主動脈瓣膜鈣化的作用已被多個研究證實，因此推測炎癥是主動脈瓣疾病初始階段的促發(fā)因素，繼而促進(jìn)主動脈瓣膜成骨反應(yīng)和鈣沉積，從而導(dǎo)致鈣化性主動脈瓣疾病的發(fā)生和發(fā)展。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)廣泛存在于真核生物中，是一個由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族。它作為信號傳導(dǎo)途徑中的樞紐，與免疫，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)以及胚胎發(fā)育等有著密切聯(lián)系，是細(xì)胞內(nèi)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB在許多細(xì)胞刺激后介導(dǎo)的細(xì)

6、胞內(nèi)信息的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用，參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控，它調(diào)控的基因編碼急性期反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子、免疫調(diào)節(jié)分子、病毒瘤基因、生長因子、轉(zhuǎn)錄和生長調(diào)控因子等。在靜息細(xì)胞中，NF-κB二聚體通過非共價鍵的形式與其抑制蛋白IκB結(jié)合而分散在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到腫瘤壞死因子(TNF)、脂多糖(LPS)等NF-κB激活劑刺激時，其抑制蛋白IκB解離和降解，NF-κB發(fā)生磷酸化，激活后的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA模塊上的特異蛋白

7、結(jié)合，誘導(dǎo)目標(biāo)mRNA的產(chǎn)生，最后轉(zhuǎn)錄、生成和釋放各種目標(biāo)產(chǎn)物。
　　 Notch蛋白是一組高度保守的細(xì)胞表面跨膜受體，在哺乳動物細(xì)胞中含有四種亞型，Notch1，Notch2，Notch3以及Notch4，Notch受體的配體有Jagged1，Jagged2，Delta like ligand(Dll)1、Dll3和Dll4。Notch被γ分泌酶裂解，釋放出其胞內(nèi)域NICD，而NICD能夠調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)及調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。近來有研究

8、表明細(xì)菌產(chǎn)物和脂多糖能夠激活單核巨噬細(xì)胞的Notch1受體，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。抑制細(xì)胞γ分泌酶，就可以抑制NICD1的產(chǎn)生，同時也減少了巨噬細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生。然而Notch1信號通路在主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中對TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)所起的作用目前尚不清楚。
　　 白介素37(IL-37)屬于白介素1家族，而白介素1家族目前擁有11個成員。至今已有五種亞型的人類IL-37被報道，分別是IL-37a、IL-37b、IL-3

9、7c、IL-37d和IL-37e。目前尚未發(fā)現(xiàn)小鼠表達(dá)IL-37，但人IL-37能在小鼠體內(nèi)發(fā)揮作用。IL-37普遍存在于扁桃體、皮膚、食道、胎盤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等組織及THP-1巨噬細(xì)胞，A549表皮細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞等細(xì)胞中。IL-37能以低親和力的方式與白介素18受體(IL-18R)結(jié)合但卻不發(fā)揮激動或拮抗作用。除了胞外作用，IL-37也能在細(xì)胞內(nèi)起作用，在細(xì)胞受到刺激后IL-37能轉(zhuǎn)入核內(nèi)并可能充當(dāng)轉(zhuǎn)

10、錄調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。體內(nèi)及體外研究均證明了人IL-37具有抗炎作用。體內(nèi)實驗，人IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠對結(jié)腸炎模型有保護(hù)作用。體外實驗，巨噬細(xì)胞及表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-37后能顯著降低LPS及IL-1誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的表達(dá)。
　　 本研究中，假想TLR4激活能誘導(dǎo)人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而這種炎癥反應(yīng)在來自主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞比來自正常瓣膜組織的細(xì)胞更明顯，TLR4信號通路與Notch1信號通路發(fā)生交互作

11、用，從而調(diào)節(jié)TLR4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)水平，而人IL-37能通過Notch1/NF-κB軸抑制TLR4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，因此本研究可能對尋找鈣化性主動脈瓣疾病的潛在防治靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。本研究中我們利用TLR4受體激活劑LPS刺激人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的TLR4受體，探討TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，以及Notch1信號通路和人IL-37對其的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制，本研究將分三部分進(jìn)行。
　　 第一部分TLR4與Notch1通路間的交互作用對人主

12、動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用
　　 目的:研究TLR4與Notch1信號通路間的交互作用對人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:分別從正常主動脈瓣膜組織和主動脈瓣狹窄病人主動脈瓣膜組織分離出人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，用TLR4激活物脂多糖(LPS)進(jìn)行干預(yù)1到24小時。用免疫印跡方法分析細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)蛋白表達(dá)。用免疫印跡和免疫熒光染色方法分析Notch1信號通路的活化水平。用酶聯(lián)免疫吸附(EL

13、ISA)方法分析單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)，白介素8(IL-8)及Notch1特異性配體Jagged1的釋放。應(yīng)用γ分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch1的活化，應(yīng)用基因沉默的方法減少Notch1蛋白表達(dá)量，減少Notch1活化分子NICD1的產(chǎn)生，用Notch1特異性配體Jagged1激活Notch1，然后分析TLR4介導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)量及MCP-1和IL-8的分泌水平。
　　 結(jié)果:LPS誘導(dǎo)人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞ICAM

14、-1蛋白的表達(dá)，MCP-1和IL-8的釋放，以及Notch1信號通路的活化。來自主動脈瓣狹窄病人主動脈瓣膜組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞比來自正常瓣膜組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和Notch1信號通路的活化以及更多的Notch1特異性配體Jagged1釋放。γ分泌酶抑制劑DAPT能抑制Notch1信號通路的活化，同時抑制TLR4介導(dǎo)的ICAM-1蛋白表達(dá)，IL-8和MCP-1釋放。用基因沉默的方法降低Notch1表達(dá)水平，能減少N

15、ICD1的生成量，同時也減少TLR4介導(dǎo)的ICAM-1蛋白表達(dá)量。Notch1受體的特異性配體Jagged1能增強(qiáng)TLR4介導(dǎo)的ICAM-1蛋白表達(dá)，IL-8和MCP-1的釋放。
　　 結(jié)論:LPS能誘導(dǎo)人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及Notch1信號通路的活化，而且這些反應(yīng)在來自主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中更明顯。Notch1通路的活化能調(diào)控TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，Notch1過度活化可能是主動脈瓣狹窄病人瓣膜組

16、織來源的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的重要機(jī)制。
　　 第二部分Notch1通路在人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的NF-κB活化的機(jī)制研究
　　 目的:探討Notch1信號通路在人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的機(jī)制。
　　 方法:分別從正常瓣膜組織和主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織分離出人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，用TLR4激活物L(fēng)PS處理細(xì)胞1到24小時。用免疫印跡和免疫組化方法分析Notch1蛋白基礎(chǔ)表達(dá)

17、水平，用免疫印跡和免疫熒光染色方法分析核因子κB(NF-κB)的活化水平，用免疫共沉淀方法分析NF-κB上游IκB激酶(IKK)和Notch1信號通路活化分子NICD1間的直接相互作用。用γ分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch1的活化，用基因沉默的方法減少Notch1蛋白表達(dá)量，用Notch1特異性配體Jagged1激活Notch1，然后分析TLR4介導(dǎo)的NF-κB的活化水平。
　　 結(jié)果:LPS誘導(dǎo)人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞NF-κB的

18、活化，其活化水平均在來自主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中增高。來自主動脈瓣狹窄病人的主動脈瓣膜組織和間質(zhì)細(xì)胞的Notch1蛋白基礎(chǔ)表達(dá)水平比來自正常瓣膜的組織和細(xì)胞高。γ分泌酶抑制劑(DAPT)能抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB的磷酸化。用基因沉默的方法降低Notch1表達(dá)水平，可減少TLR4介導(dǎo)的NF-κB的磷酸化。Notch1受體的特異性配體Jagged1能增強(qiáng)TLR4介導(dǎo)的NF-κB的活化。免疫共沉淀結(jié)果顯示NICD1與N

19、F-κB上游的IκB激酶IKK有直接相互作用。
　　 結(jié)論:LPS誘導(dǎo)人主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞NF-κB信號通路的活化，其活化水平在來自主動脈瓣狹窄病人的細(xì)胞中增高。Notch1的活化分子NICD1能通過與IKK直接相互作用調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的NF-κB的活化水平，從而調(diào)控TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　 第三部分IL-37對人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中對TLR4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制探討
　　 目的:探討IL-37在

20、人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中對TLR4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:分別從正常瓣膜和主動脈瓣狹窄病人瓣膜分離出人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，用IL-37蛋白多肽與TLR4激活物L(fēng)PS進(jìn)行干預(yù)。用免疫印跡方法分析IL-37、ICAM-1蛋白表達(dá)水平，NF-κB和Notch1信號通路的活化水平，用RT-PCR方法分析IL-37的mRNA表達(dá)水平，用免疫熒光方法分析NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)位。用基因沉默的方法減少IL-37的表達(dá)，然后分析

21、TLR4介導(dǎo)的ICAM-1蛋白表達(dá)量。
　　 結(jié)果:來自主動脈瓣狹窄病人瓣膜組織和來自正常瓣膜組織的主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞均有IL-37 mRNA和蛋白的表達(dá)，其水平在來自病變瓣膜組織的細(xì)胞較低。IL-37能抑制TLR4介導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)水平，此作用在來自病變瓣膜組織的細(xì)胞中更明顯。用基因沉默的方法減少IL-37的表達(dá)水平，可以增加TLR4介導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)量。IL-37干預(yù)能減少Notch1的活化水平，并降低TLR4介導(dǎo)的

22、NF-κB的活化水平。
　　 結(jié)論:IL-37在人主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，相對于來自正常瓣膜組織的主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，其表達(dá)水平在來自病變瓣膜組織的細(xì)胞較低。IL-37能通過抑制Notch1/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　 全文總結(jié):
　　 1.Toll樣受體4(TLR4)與Notch1通路的交互作用在人主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中能調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　 2.Notch1