鯉魚RORγ和STAT3基因的克隆及對Th17細胞免疫功能影響.pdf

1、輔助性T細胞是組成型表達TCRαβ和CD4分子的T細胞，根據(jù)CD4+T細胞在受到病原刺激的情況所分泌的細胞因子不同將其分為Ⅰ型輔助性T細胞（Th1）、Ⅱ型輔助性T細胞（Th2）和Th17細胞。其中Th17細胞的名字來源就在于它能夠主要產(chǎn)生IL-17（IL-17A和IL-17F），由它分化而來的天然免疫組分會在適應(yīng)性免疫與天然免疫共同對抗炎癥反應(yīng)構(gòu)建的第一道防線中起作用，而它大多數(shù)功能都是由其分泌物，即IL-17所決定的。Th17的作用包

2、括招募中性粒細胞、激活天然免疫細胞、增強B細胞功能、釋放促炎性細胞因子如TNF和IL-1β等。另外IL-17信號通路還可以促進細胞因子和其他炎癥因子，如胞間粘附分子、抗菌肽和金屬蛋白酶的分泌，從而維持正常的機體環(huán)境，避免組織損傷。Th17細胞可由IL-6，TGF-β，IL-21和IL-23共同誘導(dǎo)分化成為成熟Th17細胞，這過程還依賴信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子STAT3的激活。另外視黃酸相關(guān)孤兒受體RORγ和RORα也能夠作為轉(zhuǎn)錄因子參與T

3、h17細胞的分化，而RORγ的轉(zhuǎn)錄活性同時又受到STAT3的調(diào)控。
　　目前在硬骨魚中，只有斑馬魚和草魚的ROR基因被鑒定出來，包括RORα1，RORα2，RORβ， RORγ1和RORγ2，并且人們在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中對這幾個基因的表達情況進行了檢測，但對其免疫調(diào)控方式和魚類中的免疫學(xué)功能并未有研究。而STAT3在硬骨魚中雖研究相對較多，但在鯉魚中STAT3基因克隆與功能研究并無相關(guān)報道。
　　本論文以鯉魚為研究模型，首

4、先根據(jù)STAT3和RORγ的保守區(qū)設(shè)計多對引物克隆得到部分片段并將其進行拼接，首次得到了總長度為2157bp的STAT3基因完整ORF（開放閱讀框）和長度為732bp的RORγ基因編碼片段。用SMART軟件進行蛋白預(yù)測分析，確定STAT3含有一個STAT-int（2-122）結(jié)構(gòu)域及一個SH2特征性結(jié)構(gòu)域（583-664），同時還有兩個螺旋結(jié)構(gòu)域（136-223,268-292）。鯉魚RORγ基因的732bp核苷酸編碼243個氨基酸，其

5、中在46-202之間構(gòu)成了HOLI結(jié)構(gòu)域。我們對該序列與多物種進行比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)鯉魚與草魚的RORγ基因處于同一分支，相似性為85％，而STAT3的親緣關(guān)系與斑馬魚最為接近。
　　為進一步研究Th17細胞所分泌細胞因子的免疫功能，我們選取了鯉魚IL-17AF2基因作為Th17細胞的功能代表性細胞因子，克隆得到其部分片段后并通過熒光定量PCR分析其組織分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17AF2在頭腎中表達量最高，肝臟次之，其次為脾臟、

6、皮膚、前腸、后腸和鰓。為研究病毒感染后鯉魚免疫系統(tǒng)中IL-17AF2的表達變化，我們用PolyI:C注射刺激鯉魚，同時隊體外鯉魚頭腎白細胞進行刺激，分別在不同的時間段運用Real-time PCR檢測其mRNA水平，結(jié)果顯示鯉魚IL-17AF2基因的表達量均被上調(diào)，其中在頭腎和皮膚中含量升高最明顯，而在鰓中的升高變化量較小。其中在IL-17AF2基因表達上調(diào)最明顯的組織和時間段內(nèi)，STAT3和RORγ的含量均有相應(yīng)的升高。綜上檢測結(jié)果說