黃河鯉魚兩種Cyp19基因的克隆、時空表達及免疫細胞化學定位.pdf

1、在魚類性腺中，雌激素可由Cyp19基因編碼的細胞色素P450芳香化酶(aromatase)催化雄激素轉(zhuǎn)化而來。因此，Cyp19基因及其產(chǎn)物芳香化酶對于協(xié)調(diào)、維持類固醇激素之間的生理平衡有重要作用，研究Cyp19基因及芳香化酶對于了解魚類性別分化和性別決定的分子機制具有十分重要的意義。 本研究采用RT-PCR法，根據(jù)已知硬骨魚Cyp19基因序列設計兩對嵌套簡并引物，分別從黃河鯉魚腦和性腺中擴增并克隆得到兩個不同的Cyp19 DNA

2、片段，其中Cyp19a片段長700bp，Cyp19b片段長440bp。將兩個片段克隆至pUCm-T載體，以M13+，T7/M13-啟動子序列為通用引物，采用雙脫氧鏈末端終止法進行測序。同源性分析發(fā)現(xiàn)，與所得序列有較高相似性的前100個序列均為來自不同脊椎動物的Cyp19基因，最高同源性均對應于金魚的Cyp19基因，分別為Cyp19(88.2％)和Cyp19b(97.5％)。依據(jù)Cyp19基因的命名規(guī)則，我們將其分別命名為CcCyp19a

3、、CcCyp19b。系統(tǒng)發(fā)育分析表明黃河鯉Cyp19a和Cyp19b分別與其他硬骨魚類的Cyp19a和Cyp19b屬于同一分支，并且也顯示了黃河鯉和金魚分類地位最近，和傳統(tǒng)的分類地位相一致。 以GAPDH基因為參照基因，對黃河鯉在不同發(fā)育階段的成體組織和不同發(fā)育時期的胚胎中Cyp19a和Cyp19b基因的半定量。RT-PCR表達進行分析。結(jié)果表明，兩種Cyp19基因均在在卵巢和腦組織中大量表達，在精巢、腎臟、肝組織中微量表達，而

4、且，在卵巢中Cyp19a的表達高于Cyp19b，腦中則剛好相反。在胚胎中二者的表達模式有些相似，Cyp19a和Cyp19b在尾芽期表達量最高，其次是神經(jīng)胚、卵黃吸收期和孵出期。總體上，在黃河鯉胚胎的不同發(fā)育時期及各階段成體組織中，Cyp19b的表達高于Cyp19a。 免疫化學的研究結(jié)果顯示，芳香化酶在卵巢和精巢內(nèi)均呈現(xiàn)免疫細胞陽性，這與RT-PCR的結(jié)果相一致，提供了有力的形態(tài)學和分子水平的依據(jù)。這些結(jié)果為揭示細胞色素 P450