尼羅羅非魚兩種芳香化酶(Cyp19a1a和Cyp19a1b)表達與功能的初步研究.pdf

1、多數(shù)研究表明雌激素在魚類性別決定、卵巢分化與維持的過程中均起到?jīng)Q定性作用。芳香化酶是雌激素合成的限速酶，硬骨魚類有兩種芳香化酶，即卵巢芳香化酶（cyp19a1a）和腦芳香化酶（cyp19a1b），已有研究主要針對cyp19a1a在性腺以及cyp19a1b在腦的表達與作用，而少有研究聚焦于cyp19a1a在腦、cyp19a1b在性腺的表達與作用。另外，現(xiàn)有的研究多數(shù)是通過芳香化酶活性抑制劑或者雌激素受體拮抗劑等間接的手段來證明雌激素在魚類

2、性別決定、卵巢分化與維持中的作用，而幾乎沒有通過缺失功能(loss of function)或者獲得功能(gain of function)對兩種芳香化酶在性別決定與分化中的作用進行研究。尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）是世界性養(yǎng)殖魚類，雄魚比雌魚生長快50％，易獲得單性魚苗，其基因組序列已經(jīng)公開，本實驗8個性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測序相繼完成，所以尼羅羅非魚是研究性別決定與分化很好的材料。本論文主要從表達和功能兩方面來研究

3、兩種芳香化酶的區(qū)別與聯(lián)系。一方面通過Real-time PCR和免疫組化技術(shù)來研究兩者分別在性腺與腦的表達模式以及細(xì)胞類型;另一方面通過基因敲除技術(shù)研究兩者分別在性別決定與分化以及卵巢維持方面的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1) Real-time PCR表明cyp19a1b在30、180dah（day after hatching）魚腦的表達雌性高于雄性。對本實驗室測序完成的8個性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示:尼羅羅非魚中兩種芳香化酶（

4、cyp19a1a和cyp19a1b）在性腺中均有表達，且XX性腺比XY性腺表達高，兩者均在尼羅羅非魚性別決定與分化關(guān)鍵時期5 dah開始表達，在性腺的表達均在30 dah達到最高，但此時cyp19a1a高于cyp19a1b。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，cyp19a1b在腦中3 dah已經(jīng)開始表達，在180dah魚腦表達雌性高于雄性，細(xì)胞定位于腦中放射性膠質(zhì)細(xì)胞(radial glial cells，RGCs)，而cyp19a1a在180 dah的

5、腦中存在表達。兩者在性腺中的表達模式與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致。兩者在XX性腺共表達于卵巢間質(zhì)細(xì)胞，Cyp19a1b還表達于卵巢鞘膜細(xì)胞(theca cells);在XY性腺中，Cyp19a1b表達于精巢間質(zhì)細(xì)胞(Ledig cells)中，而未見Cyp19a1a在精巢表達。
　　2)利用CRISPR/Cas9靶向基因敲除技術(shù)在尼羅羅非魚XX個體成功敲除cyp19a1a或/和cyp19a1b，產(chǎn)生了多種突變類型。對照組4月齡XX性腺

6、充滿Ⅰ、Ⅱ時相卵母細(xì)胞的卵巢，而Cyp19a1a缺失導(dǎo)致XX性腺性逆轉(zhuǎn)為精巢。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，在對照組中，Cyp19a1a（雌激素合成酶—芳香化酶）特異表達于卵巢間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells），Dmrt1特異表達于精巢支持細(xì)胞(Sertoli cells)以及Cyp11b2（11β-hydroxylase，合成雄激素11-KT的關(guān)鍵酶）在精巢間質(zhì)細(xì)胞表達，而4月齡cyp19a1a缺失性腺基本檢測不到Cyp19a1a的

7、表達，但檢測到Dmrt1和Cyp11b2的表達，這進一步證實了Cyp19a1a缺失會導(dǎo)致XX性腺逆轉(zhuǎn)為精巢。5月齡Cyp19a1b缺失個體性腺減數(shù)分裂受阻，停留在卵原細(xì)胞階段，體細(xì)胞增生，不能正常發(fā)育為卵巢。免疫組化檢測Cyp19a1a、Dmrt1和Gsdf（僅表達于精原細(xì)胞和卵原細(xì)胞周圍的體細(xì)胞）在5月齡Cyp19a1b缺失性腺中的表達，結(jié)果顯示，在對照組中，Cyp19a1a在卵巢間質(zhì)細(xì)胞表達，Dmrt1在精巢支持細(xì)胞表達，Gsdf僅

8、在卵巢少量卵原細(xì)胞周圍的體細(xì)胞表達，而在5月齡Cyp19a1b缺失性腺中Cyp19a1a表達降低，Dmrt1有少量表達;存在大量的Gsdf陽性細(xì)胞，因此Gsdf染色進一步證實了Cyp19a1b缺失性腺中卵原細(xì)胞未進行減數(shù)分裂，停留在卵原細(xì)胞階段。Cyp19a1b缺失7月齡XX性腺發(fā)育為卵精巢，一部分為有卵母細(xì)胞的卵巢部分，一部分為類似精巢組織的部分。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，在Cyp19a1b缺失性腺中，Dmrt1表達于卵母細(xì)胞周圍類似精巢支持

9、細(xì)胞的體細(xì)胞中，Cyp19a1a表達于卵母細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞中，Cyp11b2表達于精巢間質(zhì)細(xì)胞中。由于敲除cyp19a1a4月齡XX性腺就已經(jīng)逆轉(zhuǎn)為精巢組織，而敲除cyp19a1b XX性腺到7月齡時才部分性逆轉(zhuǎn)，產(chǎn)生卵精巢組織，因此我們推測cyp19a1a在硬骨魚類卵巢的決定與分化起重要作用，而cyp19a1b可能對卵巢的維持起重要作用。
　　綜上所述，兩種芳香化酶均在性腺表達，XX性腺（卵巢）比XY性腺（精巢）表達高。兩者在