25OHD-,3--1α羥化酶(CYP27B1)突變基因的功能研究.pdf

1、目的:
　　 假性維生素D缺乏性佝僂病(pseudo-vitamin D-deficiency rickets，PDDR)，是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳疾病，系編碼250HD31α羥化酶的CYP2781基因突變所致，目前基因突變已發(fā)現(xiàn)近四十種，本組前期的研究首次在5名中國(guó)PDDR患者中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新突變，但這幾個(gè)突變對(duì)25OHD31α羥化酶的功能影響尚未證實(shí)。因此本實(shí)驗(yàn)的主要目的是在構(gòu)建CYP27B1體外過(guò)表達(dá)體系的基礎(chǔ)上，研究我

2、組新發(fā)現(xiàn)的2個(gè)錯(cuò)義突變G57V和L333F對(duì)250HD31α羥化酶活性的影響，進(jìn)而加深臨床醫(yī)生對(duì)于突變型和臨床表型關(guān)系的認(rèn)識(shí)。
　　 方法:
　　 1.通過(guò)定點(diǎn)誘變將突變引入連接在質(zhì)粒載體pCMVXL5上的CYP27B1cDNA，構(gòu)建突變型CYP2781基因G57V和L333F，并在體外大量擴(kuò)增，得到大量的載有野生型和突變型基因的質(zhì)粒DNA。
　　 2.通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染載有野生型和突變型基因的質(zhì)粒至293T

3、人胚腎細(xì)胞，構(gòu)建CYP27B1野生型和突變型基因的體外過(guò)表達(dá)體系
　　 3.轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的底物25OHD3，然后放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，使野生型和突變型酶在適當(dāng)條件下進(jìn)行體外羥化反應(yīng):
　　 4.收集細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)提取和C18柱純化，用放免法對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行250HD3和1，25(OH)2D3濃度的檢測(cè)，通過(guò)SPSS析因分析，比較突變型與野生型不同基因型之間是否存在顯著差異

4、r>　　 5.收集完細(xì)胞培養(yǎng)液后將細(xì)胞提取總蛋白，通過(guò)western blot檢測(cè)驗(yàn)證野生型和突變型的蛋白在體外是否有表達(dá)及表達(dá)水平是否一致。
　　 結(jié)果:
　　 1.CYP2781野生型和突變型基因在293T細(xì)胞體外過(guò)表達(dá)體系中均有所表達(dá)，而且表達(dá)水平一致。
　　 2.體外過(guò)表達(dá)的野生型和突變型CYP2781均具酶活性，可以產(chǎn)生1，25(OH)2D3并被檢測(cè)到，突變型CYP2781組1，25(OH)2D3水平