山西地區(qū)苯丙氨酸羥化酶基因突變實驗研究.pdf

1、目的:
　　85例患兒均來自山西省婦幼保健院新生兒篩查中心和門診、大同市婦幼保健院、長治市婦幼保健院、運城市婦幼保健院門診經(jīng)過各種檢查后確診為苯丙酮尿癥的患兒。年齡均在15天至7歲之間，其中48例為男性,37例為女性。初診時外周血苯丙氨酸濃度測定均在251-2621μmol/L，所有患兒在獲得了患兒家長或監(jiān)護人的知情同意的情況下均進行了血二氫喋啶還原測定、尿喋呤分析和四氫生物喋呤缺乏癥負荷試驗，將四氫生物喋呤缺乏癥排除掉。苯丙酮尿

2、癥（phenylketonuria， PKU; OMIM261600）是可以治愈的少數(shù)遺傳病之一，在我國的發(fā)病率約為1/11572，大部分患者是由于PAH基因突變，導(dǎo)致 PAH酶活性降低或消失，使得苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化而在體內(nèi)大量積蓄，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。目前國內(nèi)外對苯丙酮尿癥的診斷方法耗時長且相當繁瑣，且這些方法僅適用于已經(jīng)出生患兒的診斷，不能應(yīng)用于產(chǎn)前篩查。因此，通過對山西地區(qū)PKU患者中PAH基因的突變位點及特征的研究，探討PKU基因

3、診斷和產(chǎn)前篩查的方法，并能夠進一步豐富中國人PAH基因突變數(shù)據(jù)庫。
　　方法:
　　1、收集山西地區(qū)各醫(yī)院確診為PKU的患兒標本85例，用PCR體外擴增技術(shù)對苯丙酮尿癥患者的第3、7和11號外顯子進行擴增，進而用相應(yīng)的內(nèi)切酶進行酶切突變位點分析；
　　2、采用高分辨熔解曲線分析（High Resolution Melting，HRM）法檢測PKU患兒的5、6、7`、11和12號外顯子的常見的突變位點。
　　3、對

4、85例PKU患兒 PAH基因13個外顯子進行體外擴增和測序，然后與正常序列進行比對，統(tǒng)計全部突變信息。
　　結(jié)果:
　　1、采用 PCR-RFLP，對85例 PKU患兒中PAH基因第3、7和11外顯子突變進行檢測，經(jīng)測序驗證后，兩者結(jié)果相符；
　　2、本研究中，我們采用HRM法作為篩查工具，對85例 PKU患者進行了PAH基因的5、6、7、11和12外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)的突變篩查，經(jīng)測序驗證，PCR-HRM產(chǎn)物

5、的檢測結(jié)果與第5、6、7、11和12外顯子 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果完全吻合。
　　3、對85例患者PAH基因13個外顯子進行序列分析，其中，L11fsX7、P69H、L98V、T372R和IVS11-1G>C五個突變位點在HGMD數(shù)據(jù)庫中尚未報到，并得出R243Q、V399V和 Y204C屬于山西地區(qū)的突變熱點；
　　結(jié)論:
　　1、PCR-RFLP法具有重復(fù)性好、特異性強、準確率高和低成本的特點，為基層開展 PAH基因檢

6、測提供了簡便、快速、準確的方法；
　　2、HRM技術(shù)具有高準確度、高通量、低成本的特點，適用于 PAH基因的常見突變位點篩查，也可用于新生兒PAH基因的產(chǎn)前診斷；
　　3、通過對山西地區(qū)85例PKU患兒 PAH基因的13個外顯子突變分析，結(jié)果顯示，患有苯丙氨酸缺乏癥的患者中突變頻率最高的位點是R243Q，為15.8％，其次為V399V和Y204C。L11fsX7、P69H、L98V、T372R和IVS11-1G>C五個突變位