低溫脅迫下番茄類胡蘿卜素ε-羥化酶基因的表達(dá)和功能研究.pdf

1、低溫是一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境脅迫因子，影響作物的生長發(fā)育，并導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的降低。在低溫脅迫下植物光合能力下降，過剩光能增多，導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量積累，若不能及時(shí)清除，活性氧便會(huì)攻擊蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子對植物造成氧化脅迫損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞和組織死亡。植物在長期的演化過程中，形成了多種脅迫防御機(jī)制，其中α-胡蘿卜素衍生的黃體素能促進(jìn)過剩光能的耗散，從而保護(hù)植物避免光氧化損傷。因此，探討

2、低溫脅迫下黃體素的含量對維持光合功能的作用具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 本實(shí)驗(yàn)從番茄品種中蔬6號葉片中分離到類胡蘿卜素ε-羥化酶基因(LeLUT1)，對其序列特征、表達(dá)模式，以及轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆生理功能進(jìn)行了研究。
　　 以NC89煙草野生型(WT)和轉(zhuǎn)正義LeLUT1基因株系(T-5，T-19，T-20)為實(shí)驗(yàn)材料，通過測定黃體素在轉(zhuǎn)基因株系中的含量與冷脅迫前后煙草的生長狀況、光合速率、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、活性氧積

3、累量、膜脂過氧化程度、相對電導(dǎo)率以及D1蛋白含量等指標(biāo)的關(guān)系，研究了在冷脅迫導(dǎo)致的光抑制和光氧化中黃體素的生理效應(yīng)和功能機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　 (1)從番茄中分離到類胡蘿卜素ε-羥化酶基因LeLUT1，該基因開放閱讀框編碼(—)548個(gè)氨基酸的蛋白。同源序列比較發(fā)現(xiàn)，番茄類胡蘿卜素ε-羥化酶基因的序列與黃瓜、葡萄、蓖麻的LUT1基因的序列同源性較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，LeLUT1基因的表達(dá)受低溫(4℃)、強(qiáng)光（10

4、00μmol m-2 s-1）、聚乙二醇(PEG)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)等脅迫和信號分子調(diào)控，其表達(dá)水平隨脅迫處理時(shí)間的延長而變化。將p35S-LeLUT1-GFP融合蛋白轉(zhuǎn)化入擬南芥原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，然后通過Confocal進(jìn)行觀察，融合GFP蛋白激發(fā)的綠色熒光位點(diǎn)與胞質(zhì)葉綠素的紅色自發(fā)熒光位點(diǎn)能夠重合，這證明LeLUT1的蛋白產(chǎn)物定位于葉綠體。
　　 (2)將獲得的LeLUT1基因與含有35S啟動(dòng)子的pBI1

5、21載體重組，構(gòu)建了正義過表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，用PCR、qRT-PCR及Western blot的方法對帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)一步檢測，結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義基因的煙草植株。HPLC分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株葉片中黃體素含量高于野生型。
　　 (3)野生型相比較，過表達(dá)LeLUT1基因的煙草葉片中APX和CAT活性較高，而H2O2和O2·-含量則較低。正常生長條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因植株生長量無明顯差別

6、。但是，在低溫度脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的生長量高于野生型。這說明過表達(dá)LeLUT1提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株抵御低溫的能力。野生型和轉(zhuǎn)基因煙草株系的凈光合速率(pn)和PS(II)的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)在低溫弱光(4℃，100μmol m-2 s-1)下均降低。與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因株系T-5、T-19和T-20的下降較慢。這表明過表達(dá)LeLUT1減輕了PS(II)的光抑制。與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因株系的PS(II)反應(yīng)中心D1

7、蛋白受到的損傷較輕。低溫處理后野生型和轉(zhuǎn)基因植株中丙二醛的含量均上升，但轉(zhuǎn)基因植株的增加量較少。
　　 (4)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對野生型和轉(zhuǎn)基因煙草株系中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，低溫處理12h后轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)量與野生型相比明顯較高。
　　 (5)在冷脅迫12h后測定卡爾文循環(huán)酶類（1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶、基質(zhì)果糖-1，6-二磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶）和蔗