幾丁質(zhì)酶抑制活性蛋白酶基因和類胡蘿卜素結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)家蠶表達(dá)研究.pdf

1、隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的危害，迫切需要采用生物防治手段來替代。自然界中的農(nóng)業(yè)害蟲半數(shù)以上屬鱗翅目昆蟲，而家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，以其為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行生物防治的研究無疑有著重要的意義?；诖耍緦?shí)驗(yàn)室謝潔博士以家蠶幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)，在土壤微生物中篩選得到幾丁質(zhì)酶抑制物產(chǎn)生菌Pseudomonas sp.1237＃菌株，該菌株發(fā)酵液對(duì)家蠶幾丁質(zhì)酶具有強(qiáng)烈的抑制作用。經(jīng)鑒定該幾丁質(zhì)酶抑制物為一種彈性蛋白酶，命名為Chi-

2、Elastase。通過對(duì)Chi-Elastase N-端序列的比較分析，設(shè)計(jì)引物克隆了該蛋白酶編碼基因。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步驗(yàn)證Chi-Elastase在生物防治上應(yīng)用的可行性，本文采用家蠶GAL4/UAS系統(tǒng)對(duì)編碼該蛋白酶的成熟肽基因Chi-mELastase進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究。 另外，本文還對(duì)類胡蘿卜素結(jié)合蛋白基因(CBP)進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究。蠶繭的顏色受到相關(guān)基因的嚴(yán)格控制，黃、紅繭品系繭色以y基因的存在為前提。免疫學(xué)分

3、析表明，CBP蛋白只在攜帶Y基因的家蠶品系中存在，據(jù)此推測(cè)Y基因可能控制CBP的表達(dá)。為了進(jìn)一步探明CBP基因與Y基因的關(guān)系，本研究建立了CBP家蠶轉(zhuǎn)基因系，對(duì)CBP基因進(jìn)行功能分析。 獲得的主要結(jié)果如下： 1 UAS-Chi-mElastase轉(zhuǎn)基因家蠶品系的建立 本研究利用來源于Pseudomonas sp.1237＃菌株的彈性蛋白酶成熟肽基因Chi-mElastase，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體pBac[3xp3-D

4、sRed+UAS-Chi-mElastase]，通過顯微注射蠶卵，獲得105個(gè)G1蛾區(qū)。經(jīng)過對(duì)中后期胚胎的熒光檢測(cè)，篩選到1個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)。經(jīng)Southem blot分析表明，轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒已經(jīng)整合到家蠶染色體上，即UAS-Chi-mElastase轉(zhuǎn)基因家蠶品系構(gòu)建成功。 2 Chi-mElastase基因表達(dá)檢測(cè) 將獲得的UAS-Chi-mElastase轉(zhuǎn)基因系與A3GAL4轉(zhuǎn)基因系雜交，挑選出同時(shí)表達(dá)紅色熒光和綠

5、色熒光的轉(zhuǎn)基因蠶進(jìn)行Chi-mElastase轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析。以中腸和表皮cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示靶基因Chi-mElastase在這兩個(gè)組織中已經(jīng)被激活轉(zhuǎn)錄。 3 Chi-mElastase抗體制備及轉(zhuǎn)基因蠶蛋白質(zhì)分析 將Chi-mElastase基因編碼區(qū)序列亞克隆到pET-28a(+)表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌株。通過IPTG誘導(dǎo)重組菌pET-28a-Chi-mEl

6、astase表達(dá)蛋白，得到一個(gè)約36kD的重組蛋白(其中標(biāo)簽蛋白約6kD，目的蛋白約30kD)，與預(yù)測(cè)分子量大小相符合。表達(dá)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最佳的誘導(dǎo)條件為37℃、0.6mM/L IPTG誘導(dǎo)6h。 通過親和層析，切膠及電洗脫純化原核表達(dá)的Chi-mElastase蛋白，免疫小鼠制備抗體。Western blot分析Chi-mElastase蛋白在中腸、表皮和蛹中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示中腸、表皮中沒有檢測(cè)到雜交信號(hào)，而蛹中有雜交信

7、號(hào)的存在。平板透明圈法沒有檢測(cè)到該蛋白酶的抑制活性。 4 Chi-mElastase基因?qū)τ诩倚Q生長發(fā)育影響的調(diào)查 對(duì)UAS-Chi-mElatase轉(zhuǎn)基因系與A3GAL4轉(zhuǎn)基因系雜交后代生長發(fā)育情況進(jìn)行調(diào)查。雜交后代根據(jù)熒光表達(dá)情況分四種情況：既發(fā)紅色熒光又發(fā)綠色熒光，單發(fā)紅色熒光，單發(fā)綠色熒光和不發(fā)熒光。各挑取150頭，在25℃，相對(duì)濕度75％的智能人工氣候箱里以人工飼料飼養(yǎng)。觀察既發(fā)紅光又發(fā)綠光的轉(zhuǎn)基因蠶生長發(fā)育情

8、況，另外三種情況作為對(duì)照。結(jié)果表明轉(zhuǎn)UAS-Chi-mElatase基因蠶完成了整個(gè)生活史，沒有出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，與對(duì)照完全一致。 基于所述，本研究獲得了Chi-mElastase轉(zhuǎn)基因家蠶，RT-PCR結(jié)果顯示Chi-mElastase基因已經(jīng)被GAL4激活轉(zhuǎn)錄，Western blot分析表明Chi-mElastase基因正確表達(dá)。但沒有檢測(cè)到Chi-mElastase蛋白的幾丁質(zhì)酶抑制活性，也沒有觀察到該基因?qū)倚Q生長發(fā)育的影

9、響，轉(zhuǎn)基因家蠶完成了整個(gè)生活周期，與對(duì)照相比，并無明顯差異。本研究結(jié)果顯示，Chi-Elastase在生物防治上應(yīng)用的渠道甚至可行性，尚需進(jìn)一步探討。 5 CBP基因轉(zhuǎn)家蠶表達(dá)研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本研究將CBP基因分別與BmStart1基因上有調(diào)控序列(pBmStart1)、CBP基因上游調(diào)控序列(pCBP)及IE1啟動(dòng)子構(gòu)建成3個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。注射蠶卵后，分別獲得139個(gè)、31個(gè)和51個(gè)G1蛾區(qū)。經(jīng)過對(duì)中后期胚胎的熒光檢

10、測(cè)，分別獲得5個(gè)、1個(gè)和1個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)。經(jīng)過Southern blot及RT-PCR分析表明，3個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒都已經(jīng)整合到家蠶染色體上，并都進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄，CBP基因的表達(dá)量在IE1CBP轉(zhuǎn)基因系中最高，在pcBPCBP轉(zhuǎn)基因系中次之，在pBmStart1CBP轉(zhuǎn)基因系中最低。我們觀察了CBP轉(zhuǎn)基因家蠶的黃血黃繭性狀恢復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)除了pBmStart1CBP轉(zhuǎn)基因系外，另外兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系都恢復(fù)了部分黃血黃繭性狀，恢復(fù)程度與RT-PCR結(jié)果